Xəbərlər

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
Xərçəng hüceyrələri hüceyrə stresini aradan qaldırmaq və irəliləməyə davam etmək üçün müxtəlif mexanizmlər inkişaf etdirdi.Protein kinaz R (PKR) və onun protein aktivatoru (PACT) hüceyrə proliferasiyası və apoptozu inhibə edən müxtəlif stress siqnallarını izləyən ilkin cavab verənlərdir.Bununla belə, xərçəng hüceyrələrində PACT-PKR yolunun tənzimlənməsi əsasən naməlum olaraq qalır.Burada biz uzun kodlaşdırmayan RNT (lncRNA) aspartil tRNA sintetaza antisens RNT 1 (DARS-AS1) PACT-PKR yolunun inhibe edilməsində birbaşa iştirak etdiyini və xərçəng hüceyrələrinin yayılmasını təşviq etdiyini gördük.CRISPRi 971 xərçənglə əlaqəli lncRNA-nın geniş miqyaslı funksional skrininqindən istifadə edərək, DARS-AS1-in əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etmiş xərçəng hüceyrələrinin yayılması ilə əlaqəli olduğunu aşkar etdik.Buna görə də, DARS-AS1 nokautu hüceyrə proliferasiyasını maneə törədir və müxtəlif xərçəng hüceyrə xətlərində xərçəng hüceyrələrinin apoptozunu təşviq edir və in vivo olaraq şiş böyüməsini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır.Mexanik olaraq, DARS-AS1 birbaşa PACT aktivləşdirmə sahəsinə bağlanır və PACT-PKR qarşılıqlı təsirinin qarşısını alır, bununla da PKR aktivasiyasını, eIF2α fosforlaşmasını azaldır və apoptotik hüceyrə ölümünü maneə törədir.Klinik olaraq, DARS-AS1 çoxlu xərçənglərdə geniş şəkildə ifadə edilir və bu lncRNA-nın həddindən artıq ekspressiyası pis proqnozun göstəricisidir.Bu iş DARS-AS1 lncRNA tərəfindən PACT-PKR yolunun xərçəngə xüsusi tənzimlənməsini aydınlaşdırır və xərçəng proqnozu və müalicəsi üçün başqa bir hədəf təmin edir.
Stressə uyğunlaşma qabiliyyəti xərçəng hüceyrələrinin sağ qalmasının və yayılmasının vacib bir xüsusiyyətidir.Xərçəngin sürətli yayılması və metabolik əlamətləri sərt mikro-mühitlərdə - qida çatışmazlığı, hipoksiya və aşağı pH-da zirvəyə çatır ki, bu da hüceyrə ölümünün siqnal yollarını işə sala bilər.Xərçəngdə p535, istilik şoku zülalları 6, 7, KRAS8, 9 və HIF-110, 11, 12, 13 kimi stressə həssas genlərin tənzimlənməməsi tez-tez müşahidə edilir, bununla da apoptozu bloklayır və sağ qalmağı təşviq edir.
Protein kinaz R (PKR) hüceyrə stressini hüceyrə ölümü ilə əlaqələndirən translyasiya tənzimləyicisi olan eukaryotik başlanğıc faktoru 2α-nın (eIF2α) mühüm stress sensoru və subunit kinazıdır.PKR əvvəlcə yad ikiqat zəncirli RNT (dsRNA) aşkar edilərək antiviral zülal kimi müəyyən edilmişdir.Aktivləşdirildikdən sonra, PKR virus və hüceyrə protein sintezini maneə törətmək üçün eIF2α-nı fosforilləşdirir14,15,16.PACT (PKR aktivator zülalı) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 olmadıqda ilk PKR aktivator zülalı kimi müəyyən edilmişdir.PKR ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqə vasitəsi ilə PACT müxtəlif stressləri (serum aclığı, peroksid və ya arsenit müalicəsi) PKR və aşağı axın siqnal yollarına çevirir.eIF2α fosforilasiyasına əlavə olaraq, PACT vasitəçiliyi ilə PKR aktivasiyası stress reaksiyası ilə əlaqəli müxtəlif hadisələri, o cümlədən PI3K/Akt24 yolu ilə redoks statusunun dəyişdirilməsi, p5325,26 və NF-κB27,28 vasitəsilə gücləndirilmiş DNT zədələnməsinin yoxlanılması daxil olmaqla, transkripsiyanı tənzimləyir, 29. Stressə cavab, yayılma, apoptoz və digər əsas hüceyrə proseslərindəki kritik rolunu nəzərə alaraq, PKR və PACT bir çox xəstəliklər, xüsusən də xərçəng30,31,32,33 üçün perspektivli terapevtik hədəflərdir.Bununla belə, bu pleiotropik funksional və bioloji əhəmiyyətə baxmayaraq, xərçəng hüceyrələrində PACT/PKR fəaliyyətinin tənzimlənməsi çətin olaraq qalır.
lncRNA-lar zülal kodlaşdırma potensialı olmayan 200 nukleotiddən böyük transkriptlərdir.Ən qabaqcıl bütün genom ardıcıllığı layihələri minlərlə lncRNA-nı müəyyən etdikdən sonra, 35,36 onların bioloji funksiyalarını aydınlaşdırmaq üçün çox səy göstərilmişdir.Artan tədqiqatlar göstərir ki, lncRNA-lar bir çox bioloji proseslərdə iştirak edir37, o cümlədən X-xromosom inaktivasiyasının tənzimlənməsi38,39, çap 40, transkripsiya41,42, tərcümə43 və hətta xərçəng böyüməsi44,45,46,47.Bu tədqiqatlar bir çox lncRNA-nın PACT/PKR yolunda iştirak etdiyini bildirdi.Belə tədqiqatlardan biri göstərdi ki, lncRNA ASPACT PACT transkripsiyasını inhibə edir və PACT mRNA-nın nüvə saxlanmasını artırır.Digər tədqiqatlar göstərmişdir ki, lncRNA nc886 PKR-yə bağlanır və onun fosforlaşmasını maneə törədir49,50.İndiyə qədər PACT vasitəçiliyi ilə PKR aktivasiyasını tənzimləyən lncRNA haqqında məlumat verilməmişdir.
Aspartil-tRNA sintetaza antisens RNT 1 (DARS-AS1) onkogen lncRNA51,52,53,54 kimi müəyyən edilmişdir.miP-194-5p53, miP-12952 və miP-532-3p51-in tənzimlənməsi ilə DARS-AS1-in müvafiq olaraq şəffaf hüceyrəli böyrək hüceyrəli karsinoma, tiroid karsinoması və kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər karsinomasının böyüməsini təşviq etdiyi göstərilmişdir.Tong və həmkarları, həmçinin DARS-AS1-in protein 39 (RBM39) RNT bağlayıcı motivinin sabitliyini qorumaqla miyelomun inkişafını təşviq etdiyini tapdılar.Bununla belə, bu lncRNA-nın PACT-PKR aktivasiyasının tənzimlənməsində və xərçəng hüceyrələrinin stress reaksiyasında iştirak edib-etmədiyinə dair heç bir araşdırma aparılmamışdır.
Burada biz CRISPRi sistemindən istifadə edərək geniş miqyaslı funksiya itkisi ekranı həyata keçirdik və DARS-AS1 lncRNA-nın bir neçə növ xərçəng hüceyrələrinin yayılmasına kömək etdiyini müəyyən etdik.Bundan əlavə, biz əsas mexanizm müəyyən etdik: DARS-AS1 birbaşa PACT ilə bağlanır, PACT və PKR bağlanmasını maneə törədir, aşağı PKR substratı olan eIF2α-nın fosforilləşməsinin qarşısını alır və nəticədə apoptotik hüceyrə ölümünü maneə törədir.Nəticə olaraq, işimiz DARS-AS1 lncRNA-nı PACT-PKR yolunun tənzimləyicisi və xərçəngin müalicəsi və proqnozu üçün potensial hədəf kimi ortaya qoyur.
Geniş genomik profilləşdirmə tədqiqatları xərçənglə əlaqəli yüzlərlə lncRNA müəyyən etdi.Lakin onların funksiyası böyük ölçüdə məlum deyil56.Xərçəngin inkişafında iştirak edən perspektivli lncRNA namizədlərini müəyyən etmək üçün biz CRISPRi sistemindən istifadə edərək SW620 kolorektal xərçəng hüceyrə xəttində azalmış proliferasiya üçün funksiya itkisi ekranını həyata keçirdik (Şəkil 1a).SW480 və SW620 kolon xərçəngi hüceyrə xətlərinin unikal xüsusiyyəti onların bir xəstədə birincili və ikincili şişlərdən törəmələridir.Bu, inkişaf etmiş kolon xərçənginin inkişafında genetik dəyişiklikləri öyrənmək üçün dəyərli bir müqayisə təmin edir.Buna görə də, biz RNT ardıcıllığından istifadə edərək kolorektal xərçəng hüceyrə xətlərinin (SW480 və SW620) transkriptomlarını təhlil etdik və nəşr olunmuş ədəbiyyatdan bəzi potensial funksional lncRNA-ları topladıq.Bu nəticələrə əsaslanaraq, mənfi nəzarət üçün 971 xərçənglə əlaqəli lncRNA və 500 hədəfsiz sgRNA oliqosunu hədəf alan 7355 sgRNA oliqosunu ehtiva edən birləşdirilmiş sgRNA kitabxanası hazırladıq (Əlavə Məlumat 1).
CRISPRi sistemindən istifadə edərək skrininqin sxematik təsviri.b skrininqdən sonra sgRNA zənginləşdirilməsi.Üfüqi nöqtəli xətt log2 (qat dəyişikliyi) = ±0,58-i təmsil edir.Şaquli nöqtəli xətt p dəyərini = 0,05 göstərir.Qara nöqtələr hədəf olmayan sgRNA-nı təmsil edir (NC kimi təyin olunur).Qırmızı nöqtələr DARS-AS1-i hədəf alan sgRNA-lardır.Mavi nöqtələr əvvəllər təsvir edilmiş onkogen lncRNA olan LINC00205-i hədəf alan sgRNA-lardır.qat dəyişməsi = (normallaşdırılmış oxu, 17-ci gün)/(normallaşdırılmış oxu, gün 0).c DARS-AS1 sgRNA-nın yıxılması hüceyrə böyüməsini maneə törətdi.Səhv çubuqları üç təcrübənin ± standart sapmasını təmsil edir.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 iki quyruqlu Tələbənin t-testi.d Şişlərdə DARS-AS1 ifadəsi (TCGA verilənlər toplusu).em müvafiq olaraq BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP və COAD olan xəstələrin qoşalaşmış normal və şiş nümunələrində DARS-AS1 ifadəsi (TCGA verilənlər toplusu).p-dəyərləri qoşalaşmış iki quyruqlu Student t-testindən istifadə edərək əldə edilmişdir.
Plazmidi qurduqdan və lentivirusu qablaşdırdıqdan sonra, dörd müstəqil infeksiya təcrübəsində yuxarıdakı kitabxana ilə dCas9-SW620 kolorektal xərçəng hüceyrə xəttini köçürdük.Bu infeksiyalar üçün infeksiya çoxluğu (MOI) 0,1-0,3 idi, bu, hər bir hüceyrənin yalnız bir sgRNA ilə transfeksiya edilə biləcəyini göstərir.18 günlük in vitro mədəniyyətdən sonra, hədəf sgRNA-ların zənginləşdirmə profili skrininqdən sonra azaldı və ya artdı, qeyri-məqsədli nəzarət oliqonukleotidlərinin sayı isə əvvəlcədən skrininq profili ilə müqayisədə nisbətən dəyişməz qaldı, bu da hədəfimizin yüksək ekran spesifikliyinə malik olduğunu göstərir. kitabxana.düyü.1b və əlavə cədvəl 1). Əvvəllər ağciyər xərçəngi və qaraciyər xərçənginin irəliləməsini təşviq etdiyi bildirilən LINC0020558,59,60 yoxlanıldı (log2 (qat dəyişmə) < -0.58, p dəyəri < 0.05), bu skrininqin etibarlılığını təsdiqləyir (Şəkil 1b). Əvvəllər ağciyər xərçəngi və qaraciyər xərçənginin irəliləməsini təşviq etdiyi bildirilən LINC0020558,59,60 yoxlanıldı (log2 (qat dəyişmə) < -0.58, p dəyəri < 0.05), bu skrininqin etibarlılığını təsdiqləyir (Şəkil 1b). LINC00205, o vaxta qədər irəliləyiş əldə edə bilərsiniz, 59, 60 və 59 nömrəli kompüterlər inkişaf edir (log2 (kratnoe çıxarış) <-0,58, məlumat p <0,05), 1b). Əvvəllər ağciyər xərçəngi və qaraciyər xərçənginin inkişafını təşviq etdiyi bildirilmiş LINC0020558,59,60 xaric edildi (log2 (qat dəyişmə) <-0.58, p-dəyəri <0.05), bu skrininqin möhkəmliyini təsdiqləyir (Şəkil .1b) . Linc00205 之前 被 被 报道 可 被 和 和 肝癌 肺癌 肺癌 和 肝癌 肝癌 肺癌 和 和 肝癌 选 被 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 (图 1b). Linc00205 之前 被 被 报道 可 被 和 和 肝癌 肺癌 肺癌 和 肝癌 肝癌 肺癌 和 和 肝癌 选 被 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 (图 1b). LINC00205, o vaxta qədər irəliləyiş əldə edə bilərsiniz, məsələn, 59, 60 və 58, 59, 60-da (log2 (kratnoe çıxarış) <-0,58, p-znachenyya <0,05), müəyyən edilmiş qaydada 1b). Əvvəllər ağciyər və qaraciyər xərçənginin irəliləməsini təşviq etdiyi bildirilən LINC0020558,59,60 xaric edildi (log2 (qat dəyişmə) <-0.58, p-dəyəri <0.05), bu skrininqin möhkəmliyini təsdiqləyir (Şəkil .1b).
Sınaq edilən bütün lncRNA-lar arasında DARS-AS1 də yoxlanıldı, üç qohum sgRNA oliqonukleotidi 18 günlük mədəniyyətdən sonra əhəmiyyətli dərəcədə azaldı və bu, bu lncRNA-nın yıxılmasının xərçəng yayılmasının azalması ilə nəticələndiyini göstərir (Şəkil 1b).Bu nəticə kolorektal xərçəng hüceyrələrində MTS analizi ilə daha da dəstəkləndi və DARS-AS1 yıxılan hüceyrələrin böyümə sürətinin nəzarət hüceyrələri ilə müqayisədə yalnız iki dəfə azaldığını (Şəkil 1c) və bir neçə digər xərçəng növlərinin əvvəlki hesabatlarına uyğun olduğunu göstərdi.: şəffaf hüceyrəli böyrək xərçəngi, tiroid xərçəngi və kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçəngi51,52,53,55.Bununla belə, kolorektal xərçəngdə onun funksiyası və molekulyar mexanizmləri araşdırılmamış qalır.Buna görə də, biz əlavə tədqiqat üçün bu lncRNA-nı seçdik.
Xəstələrdə DARS-AS1 ifadəsini öyrənmək üçün Xərçəng Genom Atlası (TCGA) layihəsindən 10,327 şiş nümunəsini hərtərəfli təhlil etdik.Nəticələrimiz göstərir ki, DARS-AS1 müxtəlif şişlərdə, o cümlədən kolon adenokarsinoması (COAD), böyrək şəffaf hüceyrəli karsinoma (KIRC) və böyrək papilyar hüceyrəli karsinoma (KIRP) kimi sağlam hüceyrələrdə geniş şəkildə ifadə edilir və əhəmiyyətli dərəcədə tənzimlənir..Çox azdır (Şəkil 1d və Əlavə Şəkil 1a, b). Cütlənmiş sağlam/şiş nümunələrinin təhlili DARS-AS1-in sidik kisəsi urotelial karsinoması (BLCA), böyrək böyrək şəffaf hüceyrəli karsinoması (KIRC), prostat adenokarsinoması (PRAD), ağciyər skuamöz hüceyrəli karsinoması (LUSC) şişlərində əhəmiyyətli dərəcədə daha yüksək olduğunu təsdiqlədi. , uşaqlıq korpusunun endometrial karsinoması (UCEC), ağciyər adenokarsinoması (LUAD), qaraciyər hepatoselüler karsinoması (LIHC), böyrək böyrək papilyar hüceyrəli karsinoması (KIRP) və kolon adenokarsinoması (COAD) (p dəyəri < 0,05) (Şəkil 1e-m) . Cütlənmiş sağlam/şiş nümunələrinin təhlili DARS-AS1-in sidik kisəsi urotelial karsinoması (BLCA), böyrək böyrək şəffaf hüceyrəli karsinoması (KIRC), prostat adenokarsinoması (PRAD), ağciyər skuamöz hüceyrəli karsinoması (LUSC) şişlərində əhəmiyyətli dərəcədə daha yüksək olduğunu təsdiqlədi. , uşaqlıq korpusunun endometrial karsinoması (UCEC), ağciyər adenokarsinoması (LUAD), qaraciyər hepatoselüler karsinoması (LIHC), böyrək böyrək papilyar hüceyrəli karsinoması (KIRP) və kolon adenokarsinoması (COAD) (p dəyəri < 0,05) (Şəkil 1e-m) .Cütlənmiş sağlam/şiş nümunələrinin təhlili də DARS-AS1-in sidik kisəsi urotelial karsinoması (BLCA), şəffaf hüceyrəli böyrək və böyrək hüceyrəli karsinoması (KIRC), prostat adenokarsinoması (PRAD), ağciyər skuamöz hüceyrəli karsinoma (LUSC) şişlərində əhəmiyyətli dərəcədə yüksək ifadəsini təsdiqlədi., karsinoma endometriya tela matki (UCEC), adenokarsinoma legkogo (LUAD), gepatosellyulyarnaya karsinoma peçeni (LIHC), papillyarno-kletochnaya karsinoma poçki (KIRP) və adenokarsinoma tamstoy kişki (COAD) (znachology p <0,01e)– m). , uterinin endometrial karsinoması (UCEC), ağciyərin adenokarsinoması (LUAD), qaraciyərin hepatosellüler karsinoması (LIHC), böyrəyin papilyar hüceyrəli karsinoması (KIRP) və yoğun bağırsağın adenokarsinoması (COAD) (p dəyəri << 0,05) (Şəkil 1e– m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的本 的 的本 的 肿瘤样 的 了 了 了 Dars-as1 在 膀胱 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 (blca), 肾 肾 透明 细胞癌 (KIRC), 前列 腺腺癌 (prad), 肺鳞状 细胞癌 (Lusc), 肺鳞状 细胞癌 (Lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 高 (UCEC), 肺腺癌 (luad), 肝肝 细胞癌 (lihc), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (KIR) 和结肠腺癌 (coad) (p 值) <0,05）（图1e-m） .配 对对 / 肿瘤样本 健康 健康 健康 的 的 的 了 Dars-OS1 在 尿路 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 细胞癌 (prad), 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 中 显着 显着 显着 显着 显着 更 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 ((Ucel) 肺腺癌 (Luad) 肝肝 细胞癌 (livc) 肝肝 细胞癌 细胞癌 (liih) 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 肾 肾 肾 乳头状 乳头状 乳头状 肾 细胞癌癌 （kirp） （koad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Sağlam/şiş qoşalaşmış nümunələrin təhlili DARS-AS1-in sidik kisəsi urotelial karsinoması (BLCA), şəffaf hüceyrəli böyrək hüceyrəli karsinoması (KIRC), prostat adenokarsinoması (PRAD) və ağciyər skuamöz hüceyrəli karsinoma (LUSC) şişlərində rolunu daha da dəstəklədi.ekspressiya pri karsinome tela matki (UCEC), adenokarsinome legkogo (LUAD), gepatosellyulyarnoy karsinom (LIHC), pochechno-pochechnoy papillyarno-kletochnoy karsinom (KIRP) və adenokarsinome dolstoy kishki (COAD) (0.0)e, -m). anabir korpus karsinomasında (UCEC), ağciyər adenokarsinomasında (LUAD), hepatosellüler karsinomada (LIHC), böyrək papiller hüceyrəli karsinomada (KIRP) və kolon adenokarsinomasında (COAD) ifadə (p dəyəri <0.05) (Şəkil 1e -m).Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr DARS-AS1-in müxtəlif xərçənglərdə geniş və yüksək şəkildə ifadə edildiyini göstərir.
DARS-AS1 və DARS (antisens zəncirini kodlayan gen) eyni promotoru paylaşdığına və bir-birinin yanında yerləşdiyinə görə biz DARS-ı yox, DARS-AS1-i yıxmaq üçün shRNA hazırladıq (Əlavə Şəkil 2a,b və Əlavə Cədvəl 2) .SW620-yə əlavə olaraq, shRNA-nın yıxılmasının effektivliyini və funksiyasını öyrənmək üçün DARS-AS1-i yüksək ifadə edən üç başqa hüceyrə xəttindən də istifadə etdik (Əlavə Cədvəl 3).Nəticələrimiz göstərdi ki, inkişaf etdirilən hər üç shRNA DARS mRNA-nın miqdarına az təsir etməklə ən azı 80% DARS-AS1 yıxılma səmərəliliyinə nail olub (Əlavə Şəkil 2c-f).Bundan əlavə, biz DARS-AS1-in bu shRNA-larla yıxılmasının SW620 (49,7%) və HCT116 (27,7%), döş xərçəngi hüceyrə xətti MBA-MD-231 (53,4%) kolorektal xərçəng hüceyrə xəttlərində hüceyrə artımını əhəmiyyətli dərəcədə maneə törətdiyini aşkar etdik.) və HepG2 hepatoma hüceyrə xətti (92,7% azalma), eləcə də onların ankorsuz sferalar yaratmaq qabiliyyəti (hüceyrə xəttinə orta hesabla ~50,8%, 44,6%, 40,7% və 75,7% azalma) (Şəkil 2a,b).SW620-də koloniya formalaşması analizinin nəticələri daha da təsdiqlədi ki, DARS-AS1 shRNA orta hesabla təxminən 69,6% azalma ilə hüceyrə proliferasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə maneə törədir (Şəkil 2c).
Nəzarət shRNA və DARS-AS1 shRNA-nın SW620, HCT116, MBA-MD-231 və HepG2 hüceyrələrində hüceyrə proliferasiyasına (a) və sferoid formalaşmasına (b) təsiri.c Nəzarət shRNA və DARS-AS1 shRNA-nın SW620 hüceyrələrində koloniya formalaşmasına təsiri.DARS-AS1-i həddindən artıq ifadə edən SW620 hüceyrələrinin hüceyrə proliferasiyası (d), sferoid əmələ gəlməsi (e) və koloniya əmələ gəlməsi (f).Göstərilən məlumatlar üç təcrübənin orta ± standart sapmasıdır.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 və *** p ≤ 0,001 iki quyruqlu Tələbənin t-testi ilə.
Funksiya itkisi ilə bağlı tədqiqatları tamamlamaq üçün biz daha sonra DARS-AS1-i həddindən artıq ifadə edən SW620 hüceyrələri yaratdıq (Əlavə Şəkil 2g).DARS-AS1 həddindən artıq ifadəsi, SW620 hüceyrələrində hüceyrə artımını (1,8 dəfə), ankorsuz sferoid formalaşmasını (1,4 dəfə) və koloniya meydana gəlməsini (3,3 dəfə) əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şəkil 2d-f).Bu nəticəni başqa bir DARS-AS1 ifadə edən hüceyrə xətti, A549 istifadə edərək təsdiq etdik.DARS-AS1 həddindən artıq ifadəsi səbəbindən bu inkişaf etmiş hüceyrə proliferasiyası A549 hüceyrələrində daha da müşahidə edildi (Əlavə Şəkil 2h, i və Əlavə Cədvəl 3).Birlikdə götürdükdə, bu qazanc və zərər tədqiqatları göstərir ki, DARS-AS1 in vitro xərçəng hüceyrələrinin yayılmasını təşviq edir.
DARS-AS1-in hüceyrə proliferasiyasını tənzimlədiyi əsas mexanizmi araşdırmaq üçün onun potensial zülal bağlayan tərəfdaşlarını müəyyən etmək üçün RNT-nin aşağı açılan analizi apardıq.RT-qPCR nəticələri göstərdi ki, DARS-AS1-in təxminən 86,2%-i SW620 hüceyrələrinin sitoplazmasında yerləşir (Əlavə Şəkil 3a).In vitro transkripsiya edilmiş biotinillənmiş DARS-AS1 və ya psevdoRNA daha sonra SW620 hüceyrə lizatları ilə inkubasiya edilmiş və SDS-PAGE ayrılmışdır.Sonrakı gümüşlə boyanma göstərdi ki, fərqli bir zolaq (~38 kDa) DARS-AS1 çəkmə nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşib, lakin dummy RNT və ya muncuq nümunələrində deyil (Şəkil 3a).Bu zolaq kütləvi spektrometriya (MS) ilə PKR aktivləşdirən zülal (PACT) kimi müəyyən edildi və daha sonra SW620, HCT116 və HepG2 hüceyrə xəttlərində immunoblotlama ilə təsdiq edildi (Şəkil 3a, b).DARS və əlaqəli PACT zülallarının - PKR və TRBP - zənginləşdirilməsi də Western blotting (WB) ilə RNT analizindən istifadə edərək araşdırıldı.Nəticələr göstərdi ki, DARS-AS1 RNT ilə bu üç zülal arasında birbaşa qarşılıqlı əlaqə tapılmadı (Əlavə Şəkil 3b).DARS-AS1 və PACT arasındakı spesifik qarşılıqlı əlaqə RNT immunoprecipitation (RIP) analizi ilə daha da təsdiq edildi, bu da DARS-AS1-in anti-PACT antikorlarında əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdiyini, lakin digər nəzarət RNT-lərində deyil (Şəkil 3c) olduğunu göstərdi.DARS-AS1-in hər hansı digər hüceyrə komponentləri olmadıqda birbaşa PACT ilə qarşılıqlı əlaqədə olub-olmadığını müəyyən etmək üçün təmizlənmiş PACT istifadə edərək in vitro biolayer interferometriya (BLI) təhlili aparıldı.Biotin etiketli DARS-AS1 və ya dummy RNT streptavidin (SA) biosensorlarında immobilizasiya edildi və sonra 1 μM PACT ehtiva edən kinetik tamponda inkubasiya edildi.Xüsusilə, PACT DARS-AS1 (KD dəyəri ~26.9 nM) ilə güclü şəkildə bağlıdır, lakin RNT-ni təqlid etmir (Şəkil 3d).Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr DARS-AS1 və PACT arasında birbaşa qarşılıqlı əlaqə və yüksək yaxınlıq nümayiş etdirir.
RNT çəkmə analizi DARS-AS1-in SW620 hüceyrələrində PACT ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu müəyyən etdi.Yuxarıda, əlaqəli zülalların gümüşlə boyanması.Aşağı immunoblotlar anti-PACT antikoru ilə aparıldı.b RNT aşağı açılan analiz HCT116 (üst) və HepG2 (alt) hüceyrələrində aparılmışdır.PACT zənginləşdirilməsi immunoblotinq yolu ilə aşkar edilmişdir.cRNA immunoprecipitation (RIP) analizləri göstərilən antikorlardan istifadə edərək SW620 hüceyrələrində aparılmışdır.d Tam uzunluqlu DARS-AS1 və ya nəzarət RNT-yə PACT bağlama əyriləri biolayer interferometriyasından (BLI) istifadə etməklə əldə edilmişdir.RNT streptavidin biosensorunda immobilizasiya edildi.Əlaqəni ölçmək üçün 1 μM PACT istifadə edilmişdir.e RNT çəkmə analizi biotinləşdirilmiş tam uzunluqlu DARS-AS1 və ya kəsilmiş (yuxarı) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.PACT qəbulunu göstərən immunoblot (aşağıda).f Təmizlənmiş bayraqlı PACT biotinləşdirilmiş tam uzunluqlu DARS-AS1 ilə inkubasiya edildi və ya in vitro RIP analizi üçün kəsildi (e-də olduğu kimi).Çıxarılan RNT RT-qPCR ilə təsdiq edilmişdir.g Müxtəlif RNT fraqmentlərinin PACT üçün nisbi yaxınlığı biolayer interferometriyasından istifadə etməklə əldə edilmişdir.Təhlil üçün 100 nM RNT və 1 μM RAST istifadə edilmişdir.h In vitro RIP analizləri təmizlənmiş bütövlükdə və ya kəsilmiş etiketli PACT istifadə edərək həyata keçirilmişdir.Çıxarılan RNT RT-qPCR ilə təsdiq edilmişdir.i DARS-AS1, PACT və ya hər ikisini həddindən artıq ifadə edən SW620 hüceyrələrinin böyümə sürəti.j SW620 hüceyrələrində tam uzunluqlu və ya kəsilmiş DARS-AS1-in həddindən artıq ifadəsi hüceyrə böyüməsinə fərqli təsir göstərmişdir.k Anti-PARP antikoru ilə immunoblotinq yolu ilə apoptoz aşkar edilmişdir.l DARS-AS1-in nokautu axın sitometriyası ilə göstərildiyi kimi SW620 hüceyrələrinin apoptozuna səbəb olur.Göstərilən məlumatlar üç təcrübənin orta ± standart sapmasıdır. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, iki quyruqlu Student's t testi ilə. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, iki quyruqlu Student's t testi ilə. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 üçün dvustoronnemu kriterию Stьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 iki quyruqlu Tələbənin t-testi ilə. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 üçün dvustoronnemu kriterию Stьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 iki quyruqlu Tələbənin t-testi ilə.
Daha sonra PACT assosiasiyası üçün tələb olunan DARS-AS1 bölgəsini müəyyən etmək üçün in vitro transkripsiya ilə üç biotinləşdirilmiş DARS-AS1 RNT fraqmenti yaratdıq (Şəkil 3e).RNT analizinin nəticələri göstərdi ki, hər bir fraqment PACT ilə qarşılıqlı əlaqə qura bilir, lakin 3′-terminal bölgəsi (A3 etiketli 384-768 nukleotid) A1 ilə işarələnmiş 1-384 nukleotiddən çox göstərdi (Şəkil 3e).Oxşar nəticələr rekombinant PACT istifadə edərək in vitro RIP analizində müşahidə edilmişdir (Şəkil 3f).Bu nəticələrə uyğun olaraq, BLI istifadə edərək immobilizasiya edilmiş RNT fraqmentlərini PACT-a bağlamaq üçün aparılan təcrübələr də göstərdi ki, PACT A3 (384-768 nt) (KD dəyəri təxminən 94.6 nM) üçün daha yüksək yaxınlığa malikdir, digər sahələrlə demək olar ki, heç bir əlaqə yoxdur.(Şəkil 3d).
Biz PACT-da əlaqəli bağlama bölgələrini də araşdırdıq.PACT üç funksional domendən ibarətdir, bunlardan ikisi qorunmuş ikiqat zəncirli RNT bağlayan domenlərdir (dsRBD) və zülal qarşılıqlı təsirinin aktivatoru kimi çıxış edən üçüncü domen (təyin edilmiş D3).Hər bir domenin lncRNA bağlama qabiliyyətini yoxlamaq üçün biz üç domendən hər birini çıxaran və in vitro RIP analizini həyata keçirən üç mutasiya hazırladıq.Nəticələrimiz göstərdi ki, PACT-ın üçüncü domeninin (D3) silinməsi onun DARS-AS1 ilə qarşılıqlı təsirini (bütün PACT ilə müqayisədə 0,11 dəfə) digər iki mutasiya ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azaldır (Şəkil 3h), sərbəst buraxılması göstərildi. D3-ün DARS ilə qarşılıqlı əlaqəsi.-AC1.Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr göstərir ki, DARS-AS1 və PACT arasında qarşılıqlı əlaqə əsasən DARS-AS1-in 3′ sonu və PACT-ın D3 domeni vasitəsilə baş verə bilər.
DARS-AS1-in PACT ifadəsinə və PACT-ın DARS-AS1-ə heç bir təsiri olmadığını qeyd etdik (Əlavə Şəkil 3c).Daha sonra PACT-ın yıxılmasının hüceyrə böyüməsinə təsirini araşdırdıq.DARS-AS1-dən fərqli olaraq, PACT yıxıldıqda nisbi hüceyrələr 1,5-3 dəfə daha sürətli böyüdü (Əlavə Şəkil 3d).Koloniya formalaşması analizinin nəticələri göstərdi ki, PACT ilə shRNA müalicəsindən sonra hüceyrələr 2-3 qat koloniyalar əmələ gətirir (Əlavə Şəkil 3e).DARS-AS1-in PACT vasitəsilə hüceyrə proliferasiyasını tənzimlədiyini yoxlamaq üçün biz PACT, DARS-AS1 və ya hər ikisini həddindən artıq ifadə edən SW620 hüceyrələri yaratdıq.PACT-ın həddindən artıq ifadəsi hüceyrə proliferasiyasının əhəmiyyətli dərəcədə inhibəsini göstərdi (Şəkil 3i).DARS-AS1 həddindən artıq ifadəsi özlüyündə hüceyrə proliferasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə təşviq etsə də, DARS-AS1 və PACT-ı həddindən artıq ifadə edən hüceyrələrin böyümə sürətində əhəmiyyətli fərq yox idi.Bu nəticələr PACT-ın DARS-AS1 həddindən artıq ifadəsi nəticəsində yaranan artan yayılmanın qarşısını ala biləcəyini göstərir.
DARS-AS1-in müxtəlif bölgələri fərqli PACT bağlama qabiliyyətinə malik olduğundan, DARS-AS1 fraqmentlərinin müxtəlif ifrat ifadəsi ilə onların hüceyrə proliferasiyasına nisbi təsirini araşdırdıq.Digər iki fraqmentlə müqayisədə, DARS-AS1 hüceyrə proliferasiyasını stimullaşdırmaq üçün ən yüksək qabiliyyətə malik olan DARS-AS1-də əsas PACT ilə əlaqəli bölgə olan 3' sonunda (384-768 nt) həddindən artıq ifadə edildi (Şəkil 3j).Bu nəticələr DARS-AS1-in bağlama qabiliyyəti ilə bioloji funksiyası arasında müsbət əlaqə olduğunu göstərir.
PACT-ın apoptotik bir zülal olduğu bildirildi19.Buna görə də DARS-AS1-in apoptoza təsirini araşdırdıq.Gözlənildiyi kimi, DARS-AS1 yıxılması SW620 hüceyrələrində PARP parçalanmasını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı və SW620, HCT116, HepG2 və MBA-MD-231 hüceyrə xəttlərində anneksin V-müsbət hüceyrələrin nisbətini artırdı (Şəkil 3k).3).3f-h), xərçəng hüceyrələrində DARS-AS1-in anti-apoptotik təsirinin PACT-ın apoptoza səbəb olan funksiyasının əksinə olduğunu göstərir.Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr DARS-AS1 onkogen funksiyasının mexanizminin PACT funksiyasının inhibe edilməsi ilə ola biləcəyini göstərir.
Sonra, DARS-AS1-PACT assosiasiyasının funksional nəticələrini araşdırdıq.PACT-ın birbaşa qarşılıqlı təsir vasitəsilə PKR-ni aktivləşdirdiyi bildirilmişdir ki, bu da sonradan eIF2α fosforilasiyasını gücləndirərək translyasiya silinməsinə və apoptoza səbəb olur17.Əvvəlcə DARS-AS1-in PACT və PKR-nin hüceyrə lokalizasiyasına təsir edib-etmədiyini araşdırdıq.Konfokal flüoresan mikroskopiyası göstərdi ki, PACT və PKR orta Pearson korrelyasiya əmsalı 0,72 olan SW620 hüceyrələrində yüksək dərəcədə kolokallaşdırılıb.Eyni zamanda, DARS-AS1 həddindən artıq ifadəsi PACT və PKR birgə lokalizasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb (ortalama Pearson korrelyasiya əmsalı 0.61) (Şəkil 4a).DARS-AS1-in PACT-PKR qarşılıqlı təsirini modullaşdıra bilib-bilmədiyini araşdırmaq üçün biz SW620 hüceyrə lizatlarında anti-PACT antikoru ilə birgə immunopresipitasiya (ko-IP) analizi apardıq.PKR nəzarət hüceyrələrində anti-PACT ilə yüksək zənginləşdirilmişdir, PKR bərpası isə DARS-AS1-i həddindən artıq ifadə edən hüceyrələrdən lizatlarda əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil 4b).Təmizlənmiş etiketli PACT və PKR in vitro zülal bağlama analizləri üçün istifadə edilmişdir.Müvafiq olaraq, DARS-AS1 təmin edən, lakin heç bir nəzarət RNT-si olmayanlar PACT-PKR qarşılıqlı təsirini göstərdi (Şəkil 4c).Bütün nəticələr DARS-AS1-in PACT və PKR rabitəsini pozduğunu göstərdi.
Nəzarət hüceyrələrində və ya DARS-AS1-i həddindən artıq ifadə edən hüceyrələrdə PACT və PKR-nin birgə lokalizasiyası konfokal flüoresan mikroskopiyadan istifadə edilərək müşahidə edilmişdir.Nüvələr DAPI ilə boyandı.16 fotoşəkildən statistik nəticələr əldə edilmişdir.b Nəzarət SW620 hüceyrələrinin hüceyrə lizatlarında və ya DARS-AS1-i həddən artıq ifadə edən hüceyrələrdə anti-PACT antikorundan istifadə edərək birgə immunopresipitasiyalar (ko-IP).c Etiketli PACT, təmizlənmiş PKR və DARS-AS1 və ya saxta RNT ilə in vitro transkripsiya edilmiş in vitro protein bağlama analizi üçün inkubasiya edilmişdir.İmmunopresipitasiya üçün bayraq əleyhinə antikorlardan istifadə edilmişdir.d Göstərilən antikorlarla immunoblotlar nəzarət shRNA və ya DARS-AS1-shRNA ilə transfeksiya edilmiş SW620 və HCT116 hüceyrələrində həyata keçirildi, ardınca serum aclığı müşahidə edildi.e DARS-AS1 ifadə səviyyələri thapsigargin üçün hüceyrə həssaslığını dəyişdirdi.SW620 hüceyrələri DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 həddindən artıq ifadə plazmidi və ya nəzarət plazmidi ilə transfeksiya edildi.Hüceyrələr 48 saat ərzində thapsigargin ilə müalicə edildi və hüceyrənin canlılığı MTS reagentindən istifadə edilərək müəyyən edildi.f In vitro transkripsiya edilmiş DARS-AS1 və ya dummy RNT və təmizlənmiş PACT in vitro aktivasiya testi və immunoblotun aşkarlanması üçün istifadə edilmişdir.g Bu antikorlardan istifadə edərək immunoblotlar SW620-ctrl hüceyrələrində (solda) və ya PKR mutantlarını həddindən artıq ifadə edən hüceyrələrdə (sağda) həyata keçirilib.Bu hüceyrələr daha sonra nəzarət shRNA və ya DARS-AS1-shRNA ilə transfeksiya edildi və ardınca serum aclığı müşahidə edildi.h Flow sitometriyası göstərdi ki, mutant PKR-nin inaktivasiyası SW620 hüceyrələrində DARS-AS1-in səbəb olduğu apoptozu kompensasiya edir.i Göstərilən antikorları olan immunoblotlar SW620 (solda) və ya HCT116 (sağda) hüceyrələrində aparılmışdır.Nəzarət shRNA və ya DARS-AS1 shRNA ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələr serumdan məhrumdur və 100 nM PKR C16 inhibitoru və ya DMSO ilə tamamlanır.Ölçək çubuğu = 5 µm.Göstərilən məlumatlar üç təcrübənin orta ± standart sapmasıdır.* p ≤ 0.05 iki quyruqlu Tələbənin t-testi.
Ümumiyyətlə güman edilir ki, PACT PKR17 ilə qarşılıqlı əlaqədə olduqda, Thr451-də PKR fosforilasiyası induksiya edilə bilər.Nəticələrimiz göstərdi ki, zərdab aclığından sonra DARS-AS1 yıxılan hüceyrələrdə PKR fosforlaşma səviyyəsi əhəmiyyətli dərəcədə yüksəldi (Şəkil 4d və Əlavə Şəkil 4a).Müvafiq olaraq, əsas PKR substratı olan eIF2α-nın fosforilləşməsinin də DARS-AS1 shRNA tərəfindən əhəmiyyətli dərəcədə artdığını aşkar etdik (Şəkil 4d və Əlavə Şəkil 4a).Thapsigargin ER-nin Ca2+ ifrazına səbəb olan bir ER stressorudur.Thapsigargin ilə müalicənin PKR ilə daha da qarşılıqlı əlaqədə olan və aktivləşdirən PACT-ın ifadəsini və aktivləşməsini stimullaşdırdığı və eIF2α fosforilasiyasını artıraraq apoptoza səbəb olduğu bildirildi 18,61.Burada DARS-AS1-in PACT/PKR yolunu maneə törətməklə hüceyrələrə stressin öhdəsindən gəlməyə kömək edə biləcəyini araşdırmaq üçün PACT/PKR yolunun stimulatoru kimi thapsigargindən istifadə etdik.DARS-AS1 ifadəsinin səviyyəsinin thapsigarginə qarşı hüceyrə müqaviməti ilə müsbət əlaqədə olduğunu müşahidə etdik.DARS-AS1-i həddindən artıq ifadə edən SW620 hüceyrələri thapsigargin ilə müalicə edildikdə daha yaxşı sağ qaldı, DARS-AS1 yıxılan hüceyrələr isə daha həssas oldu (Şəkil 4e).Bu nəticələrə uyğun olaraq, DARS-AS1 həddindən artıq ifadəsi thapsigargin tərəfindən induksiya olunan PKR fosforlaşmasını azaldır (Əlavə Şəkil 4b).Bunun əksinə olaraq, thapsigargin müalicəsindən sonra PKR və eIF2α, nəzarət hüceyrələri ilə müqayisədə DARS-AS1 yıxılan hüceyrələrdə daha yüksək dərəcədə fosforlaşdırıldı (Əlavə Şəkil 4b).Maraqlıdır ki, thapsigargin DARS-AS1 ifadəsini dozadan asılı olaraq induksiya etdi, bu da DARS-AS1-in anti-stress funksiyasını göstərə bilər (Əlavə Şəkil 4c).Bundan əlavə, biz bu müşahidələri təsdiqləmək üçün in vitro aktivasiya testlərini həyata keçirdik.Qısaca olaraq, PKR anti-PKR antikorundan istifadə edərək hüceyrə lizatlarından təmizlənmiş, sonra rekombinant PACT və in vitro transkripsiya edilmiş DARS-AS1 ilə inkubasiya edilmişdir.Enzimatik reaksiyadan sonra WB istifadə edərək fosfo-PKR aşkar edilmişdir.Nəticələrimiz göstərdi ki, PKR fosforilasiyası DARS-AS1 tərəfindən əhəmiyyətli dərəcədə inhibə edilib, lakin nəzarət RNT tərəfindən deyil (Şəkil 4f).Bu in vitro və in vivo nəticələr göstərir ki, DARS-AS1 PACT vasitəçiliyi ilə PKR aktivləşməsini maneə törədir.Eyni zamanda, biz də DARS-AS1 (Şəkil 4f) varlığında PACT bərpasında azalma müşahidə etdik.Bu nəticə in vitro zülal bağlama analizinin nəticələrinə uyğundur (Şəkil 4c) və yenidən PACT-PKR assosiasiyası üçün DARS-AS1-in bloklama funksiyasını göstərir.
PACT-ın D3 domenindəki Ser246 və Ser287 hüceyrə stressi altında PKR aktivasiyası üçün tələb olunur.Alanin üçün iki serin qalıqlarının dəyişdirilməsi, stress olmadıqda PKR-ni aktivləşdirən mutant PACT (mutD) verdi və alanin (mutA) üçün əvəzetmə protokolu dəyişdirdi.Bu domenin DARS-AS1 ilə birbaşa əlaqədə əhəmiyyətini nümayiş etdirdiyimiz üçün biz bu qalıqların DARS-AS1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olub-olmadığını yoxlamaq üçün bu iki PACT mutantını yaratdıq.Maraqlıdır ki, hər iki mutant DARS-AS1-ə bağlanma qabiliyyətini itirdi (Əlavə Şəkil 4d), bu, DARS-AS1 ilə effektiv qarşılıqlı əlaqə üçün PACT zülalının tam strukturunun tələb oluna biləcəyini göstərir.
Bundan əlavə, nəticələrimiz həmçinin göstərir ki, DARS-AS1-shRNA ilə induksiya olunan hüceyrə proliferasiyasının inhibəsi dominant mənfi PACT mutantını (PACTmutA) və ya dominant mənfi PKR mutantını (PKRmut) həddindən artıq ifadə etməklə qismən bərpa edilə bilər (Əlavə Şəkil 4e. e).Dominant-mənfi PKR mutantlarının həddindən artıq ekspressiyası DARS-AS1-in yıxılması ilə induksiya edilən PKR fosforilasiyasını, eləcə də serumdan məhrum olan hüceyrələrdə eIF2α fosforlaşmasını azaldır (Şəkil 4g).Daha da əhəmiyyətlisi, DARS-AS1-in yıxılması ilə səbəb olan apoptotik hüceyrələrin nisbəti PKRmutu həddindən artıq ifadə edən hüceyrələrdə də azaldı (Şəkil 4h və Əlavə Şəkil 4g).PKR kinaz aktivliyinin inhibəsi DARS-AS1 funksiyasını da pozur, çünki nəticələr hüceyrələr PKR-ə xüsusi C16 inhibitoru ilə müalicə edildikdə DARS-AS1-in yıxılması nadir hallarda PKR və eIF2α fosforlaşmasını tetiklediğini göstərdi (Şəkil 4i və Əlavə Şəkil 4h).).Birlikdə götürdükdə, əldə etdiyimiz nəticələr göstərir ki, DARS-AS1 PACT vasitəçiliyi ilə PKR aktivasiyasını maneə törətməklə, ən azı qismən hüceyrə proliferasiyasını təşviq edir.
DARS-AS1-in şişin meydana gəlməsində rolunu daha da araşdırmaq üçün siçan ksenograft modelindən istifadə edərək in vivo təcrübələr apardıq. Nəticələr göstərir ki, DARS-AS1-in yıxılması siçanlarda şiş böyüməsini kəskin şəkildə azaldır (p dəyəri <0.0001) (Şəkil 5a). Nəticələr göstərir ki, DARS-AS1-in yıxılması siçanlarda şiş böyüməsini kəskin şəkildə azaldır (p dəyəri <0.0001) (Şəkil 5a). DARS-AS1 rezko snijaet sağ opuxoli u мышей (значение p <0,0001) (ris. 5a). Nəticələr göstərir ki, DARS-AS1 yıxılması siçanlarda şiş böyüməsini kəskin şəkildə azaldır (p dəyəri <0.0001) (Şəkil 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 snachitelno snijaet sağ optuxoli u мышей (значение р <0,0001) (ris. 5a). Nəticələr göstərdi ki, DARS-AS1 yıxılması siçanlarda şiş böyüməsini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır (p dəyəri <0.0001) (Şəkil 5a).Beləliklə, DARS-AS1 yıxılan qrupda orta şiş həcmində təxminən 72,9% və orta şiş kütləsində təxminən 87,8% əhəmiyyətli azalma müşahidə edildi (Şəkil 5b-d).Bu nəticələr güclü şəkildə göstərir ki, DARS-AS1 in vivo şiş böyüməsini əhəmiyyətli dərəcədə təşviq edə bilər.
DARS-AS1 reklamının çılpaq siçanlarda kolorektal onkogenezə təsiri.Böyümə əyriləri (a), şiş ölçüsü (b), çəki (c) və şiş şəkilləri (d) göstərilir.Səhv çubuqları ±SEM-i təmsil edir. n = 10. ****p < 0,0001, iki quyruqlu Student's t testi ilə. n = 10. ****p < 0,0001, iki quyruqlu Student's t testi ilə. n = 10. ****p < 0,0001 üçün ikiqat kriterию Stьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 iki quyruqlu Tələbənin t-testi.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 üçün iki kriteriya Styudenta. ****p < 0,0001 iki quyruqlu Tələbənin t-testi.e Kaplan-Meier, UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM və LGG olan xəstələrdə DARS-AS1 ifadə səviyyələri ilə ümumi sağ qalma arasındakı əlaqəni təhlil etdi.Xəstələrdə yüksək səviyyəli DARS-AS1 ifadəsi ilk 50% idi;xəstələrdə DARS-AS1 ifadəsinin aşağı səviyyəsi ən aşağı 50% idi.p-dəyərləri log rank testindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir.f DARS-AS1-in PACT-PKR yolunu və şiş böyüməsini tənzimlədiyi təklif olunan model.
DARS-AS1-in klinik təsirini daha yaxşı başa düşmək üçün onun ifadəsi ilə xəstənin sağ qalması arasındakı əlaqəni araşdırdıq.TCGA məlumat dəstini təhlil edərək, daha yüksək DARS-AS1 ifadəsinin uveal melanoma (UVM), böyrək xromofobiyası (KICH), böyrək papiller hüceyrəli karsinoma (KIRP), mezotelioma (MESO), multipleks ilə əlaqəli olduğunu gördük.Aşağı sağ qalma əhəmiyyətli dərəcədə glioblastoma morfozu (GBM) və aşağı dərəcəli beyin glioması (LGG) olan xəstələrlə əlaqələndirildi (Şəkil 5e).Bu nəticələr göstərir ki, DARS-AS1 şişin klinik inkişafında mühüm rol oynaya bilər və bir çox xərçənglərdə potensial proqnozlaşdırıcı biomarker ola bilər.
Bu işdə, geniş miqyaslı CRISPRi funksional skrininqindən istifadə edərək, DARS-AS1 lncRNA-nın iki əsas stress cavabdehini, PACT və PKR-ni tənzimləyərək xərçəng hüceyrələrinin stresini dəf etdiyini müəyyən etdik.Birbaşa PACT ilə qarşılıqlı əlaqə quraraq, DARS-AS1 PACT vasitəçiliyi ilə PKR aktivləşdirməsini maneə törədir, beləliklə apoptotik hüceyrə ölümünün qarşısını alır və hüceyrə proliferasiyasını təşviq edir (Şəkil 5f).DARS-AS1-in tənzimlənməsi bir çox xərçəng növlərində müşahidə edilmişdir ki, bu da onun stressli şəraitdə xərçəng hüceyrələrinin sağ qalmasını təşviq etmək funksiyasının bir çox xərçəng növlərinə geniş şəkildə tətbiq oluna biləcəyini göstərir.
PACT PKR aktivator zülalı kimi müəyyən edilmişdir və PACT vasitəçiliyi ilə PKR aktivləşdirilməsi transkripsiya, tərcümə, apoptoz və digər mühüm hüceyrə proseslərini tənzimləməklə stress reaksiyalarında mühüm rol oynayır62.Onilliklər ərzində PACT-PKR kaskadının xərçəngə xas tənzimləməsini anlamaq üçün cəhdlər edilmişdir.Burada araşdırmamız PACT-a birbaşa bağlanan, PACT-PKR qarşılıqlı təsirini bloklayan, PKR aktivasiyasını və eIF2α fosforlaşmasını maneə törədən, bununla da stressin səbəb olduğu apoptozu və son xərçəng yayılmasını stimullaşdırır.hüceyrələr.Bu kəşf xərçəng proqnozu və müalicəsi üçün potensial lncRNA hədəflərinə işıq salır.
Məlumatlarımız göstərdi ki, DARS-AS1 yıxılması hüceyrələri fosforlanmış PKR və eIF2α-da əhəmiyyətli artımla serum aclığına həssaslaşdırır.Bu nəticələr göstərir ki, DARS-AS1 PACT/PKR fəaliyyətini maneə törətməklə ağır şəraitdə xərçəng hüceyrələrinin sağ qalmasını təşviq edir.ASPACT və nc886 kimi bir neçə digər kodlaşdırmayan RNT də PACT48 mRNA-nı aşağı tənzimləməklə və ya PKR49,50,64-ə bağlanaraq avtofosforilasiyanı tənzimləməklə PACT/PKR oxunda iştirak edir.Onların arasında DARS-AS1 PACT-PKR assosiasiyasının pozucusu kimi çıxış edir.Bu araşdırma PACT/PKR oxunun tənzimlənməsi və lncRNA-ların stress reaksiyalarında rolu haqqında anlayışımızı zənginləşdirir.
PACT üç ayrı domendən ibarətdir.İlk iki dsRBD-nin hər biri PACT-ın PKR-yə yüksək yaxınlıqda bağlanmasına nail olmaq üçün kifayətdir, üçüncü domen (D3) isə PKR-nin in vitro və in vivo aktivləşdirilməsi üçün tələb olunur.Tədqiqatımız göstərdi ki, DARS-AS1 üstünlük olaraq D3 ​​domeni ilə qarşılıqlı əlaqədə olur (Şəkil 3h).LncRNA-nın (768 nukleotid) böyük ölçüsünü nəzərə alaraq, DARS-AS1-in D3-ə bağlanması dsRBD və PKR-nin PACT domeni arasında qarşılıqlı əlaqəni fiziki olaraq maneə törədə bilər, bununla da PACT və PKR assosiasiyasını bloklayır.D3-də Ser246 və Ser287-ni alanin və ya aspartat ilə əvəz edən PACT nöqtəsi mutasiyaları onun DARS-AS1 üçün bağlanma yaxınlığını pozaraq, onların birləşməsində D3-ün ümumi struktur və elektrik xüsusiyyətlərinin əhəmiyyətinə işarə etdi.Gələcəkdə daha dəqiq biokimyəvi analiz və yüksək rezolyusiyaya malik PACT struktur analizindən istifadə edərək, bu mexanizmin əlavə təfərrüatları tələb olunacaq.
Əvvəlki tədqiqatlar DARS-AS1-in bir neçə mexanizm vasitəsilə hüceyrə proliferasiyasını təşviq etdiyini bildirmişdir51,52,53.Bir nümunədə, tədqiqatçılar DARS-AS1-in böyrək xərçəngi hüceyrələrində miP-194-5p-ni hədəf alaraq antisens protein kodlayan DARS genini tənzimlədiyini müşahidə etdilər.Bununla belə, bu araşdırmada DARS-AS1 yıxılması ən azı kolorektal, döş və qaraciyər xərçəngləri də daxil olmaqla bir çox xərçəng növlərində DARS transkripsiyasına az təsir göstərmişdir.LncRNA-lar hüceyrə və toxuma spesifik ifadə nümunələri nümayiş etdirdiyindən, funksional mexanizmlər xərçəng növləri arasında qorunmaya bilər ki, bu da müşahidələrimiz və müxtəlif xərçənglərin əvvəlki qiymətləndirmələri arasında bu uyğunsuzluğa kömək edə bilər.Müxtəlif fizioloji və patoloji proseslərin spesifik mexanizmlərini aydınlaşdırmaq üçün xüsusi tədqiqatlar lazımdır.
Klinik məlumatların təhlili göstərdi ki, şişlərdə DARS-AS1 ifadəsi xərçəng xəstələrinin sağ qalması ilə tərs korrelyasiya olunur ki, bu da DARS-AS1/PACT/PKR oxunun xərçəng proqnozunda əhəmiyyətini vurğulayır.Nəticə olaraq, araşdırmamız göstərir ki, DARS-AS1 PACT/PKR siqnal oxunun tənzimləyicisidir, xərçəng hüceyrələrinin yayılmasını təşviq edir və stress reaksiyası zamanı apoptozu inhibə edir ki, bu da başqa bir araşdırma xəttini təmin edir və potensial müalicələrə dair gələcək tədqiqatlar üçün maraq doğurur. .
İnsan hüceyrə xətləri SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 və HEK293T Çindəki Milli Cell Line Resurs İnfrastrukturundan əldə edilmişdir.Bütün hüceyrələr 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) və 1% penisilin-streptomisin (Thermo Fisher Scientific) ilə əlavə edilmiş DMEM mühitində (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 37°C, 5% CO2-də saxlanıldı.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normal siçan IgG, CST (5415S);normal dovşan IgG, CST (2729S).Antikorlar Western blotting üçün PBST-də 1:1000 və İP üçün 1:100 nisbətində seyreltildi.
sgRNA-lar CRISPR-ERA66 adlı ictimaiyyətə açıq bir alətdən istifadə etməklə hazırlanmışdır.Biz sgRNA inkişafı üçün standart alət parametrlərindən və 3 kb bölgəsində hesablanmış sgRNA bağlama yerlərinin alqoritmindən istifadə etdik.mərkəzi TSS.sgRNA oliqonukleotidlərinin hovuzları CustomArray, Inc.-də (Bothewell, WA) sintez edilmiş və insanlaşmış pgRNA plazmidlərinə klonlaşdırılmışdır (Addgene #44248).Cəmi 12 µg toplanmış humanizə olunmuş pgRNA plazmidi, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) və 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) 10 mkq reaktiv transfeksiyadan istifadə edərək 5 x 106 HEK293T-ə transfeksiya edildi. hüceyrələri (CWBIO, Pekin, Çin) istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq.Virus tərkibli supernatantlar transfeksiyadan 48 və 72 saat sonra toplanmış və 0,45 µm filtrdən süzülmüşdür.Skrininq üçün dCas9/KRAB füzyon zülalını ifadə edən SW620 hüceyrələri virus ötürülməsi yolu ilə əldə edilmişdir.Dəyişdirilmiş SW620 hüceyrələri MOI-də 0,1-0,3 olan dörd müstəqil infeksiya təcrübəsində virus kitabxanası ilə yoluxmuş və 2 gün ərzində 2 μg/ml puromisin (Sigma, St. Louis, MO) ilə nümunə götürülmüşdür.Bundan sonra, hüceyrələr skrininq üçün 500 hüceyrə/sgRNA minimum kitabxana əhatəsi ilə in vitro 18 gün ərzində becərildi.
Genomik DNT QIAamp DNT Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Almaniya; 51183) təlimatlarına uyğun olaraq çıxarılmışdır.Ümumilikdə kitabxananın qurulması üçün hər bioloji təkrar üçün 100 μg genomik DNT istifadə edilmişdir.sgRNA bölgəsi iki dövrə PCR ilə gücləndirildi və barkodla əlaqələndirildi.
PCR məhsulları NucleoSpin® gel və PCR təmizləmə dəsti (MACHEREY-NAGEL, Düren, Almaniya; 740609.250) istifadə edilərək təmizləndi və Qubit™ HS ikiqat zəncirli DNT aşkarlama dəsti (Thermo Fisher Scientific; Q32854) istifadə edilərək kəmiyyəti müəyyən edildi.
MTS analizi hüceyrə proliferasiyasını ölçmək üçün istifadə edilmişdir.Hüceyrələr 2000 hüceyrə/quyuğun ilkin sıxlığında 96 quyu boşqablarına səpildi.Hüceyrələrin nisbi sayı hər gün göstərilən vaxtda cəmi 4-6 gün ərzində ölçüldü.Hər quyu üçün 20 μl MTS reagenti (Promega) 100 μl DMEM ilə seyreltildi, hüceyrələrlə 4 saat ərzində 37°C-də inkubasiya edildi və sonra OD490 ölçüldü.
Sferaların əmələ gəlməsinin təhlili ilə ankorsuz böyümə qabiliyyəti aşkar edilmişdir.Qısaca olaraq, shRNA DARS-AS1 və ya nəzarət shRNA ilə transfeksiya edilmiş 2000 hüceyrə hər 4 gündən bir orta dəyişikliyə malik ultra aşağı əlavə mikroplitələrdə (Corning) becərildi.Sferoidlər 14 gündən sonra sayılır.DARS-AS1 həddindən artıq ifadə plazmidi və ya nəzarət plazmidi ilə transfeksiya edilmiş 500 hüceyrə gücləndirmə analizi üçün istifadə edilmişdir, əks halda üsul dəyişməmişdir.
RNT T7 RNT polimeraz və biotin-16-UTP (Roche 1138908910) istifadə edərək Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) təlimatlarına uyğun olaraq transkripsiya edilmişdir.Burada istifadə olunan primerlər Əlavə Cədvəl 4-də verilmişdir.
Protein kodlayan PACT və ya PKR bölgələri pET15b (Addgene #73619)-a klonlaşdırıldı və BL21(DE3)-ə çevrildi.Bakteriyalar bir gecədə ampisilinlə təchiz edilmiş LB-də inkubasiya edildi və sonra təzə LB ilə 100 dəfə seyreltildi.Mühitin OD600-ü 0,8-ə çatdıqda, protein ifadəsini stimullaşdırmaq üçün 1 mM IPTG əlavə edildi.Gecədə yumşaq silkələnmə ilə (20°C-də 250 rpm) inkubasiyadan sonra hüceyrə qranulları sentrifuqalama (4000 rpm, 10 dəq, 4°C) ilə toplandı.Hüceyrə qranulunu lizis tamponunda (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) yenidən dayandırın və 30 dəqiqə buzda inkubasiya edin, sonra sonikasiya edin (15 dəq, 5 s yandırın/söndürün, buzda) və sentrifuqalayın (13,0000) rpm)., 30 dəq, 4°С).Sonra supernatant Ni-NTA qatranına (QIAGEN) 3 dəfə 4°C-də yükləndi, 4 dəfə yuma tamponu (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) ilə yuyuldu və cəmi 3 dəfə elüt edildi. 10 ml eluent tampondan (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Təmizlənmiş zülal WB istifadə edərək müəyyən edildi və konsentrasiya Qubit™ protein analiz dəsti (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) ilə müəyyən edildi.
RIP analizləri daha əvvəl təsvir olunduğu kimi, dəyişikliklərlə aparılmışdır.Qısaca olaraq, 1x RIP tamponu (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonukleaza inhibitoru (Promega), PMSF (Beyotime Biotexnologiya), 1 mM DDM, proteaz) xtostatic x101ck7-ni lizis edir. (Roche, 1 mM DTT) və 4 °C-də 15 dəqiqə 13000 rpm-də sentrifuqa edin.Daha sonra supernatant 5 μg anti-PACT antikoru (Abeam) və ya IgG (CST) ilə birləşdirilmiş protein A+G maqnit muncuqları (Millipore) ilə inkubasiya edilmişdir.Muncuqlar 5 dəfə 5x RIP tamponu ilə yuyuldu, sonra proteinaz K (NEB) ilə həzm olundu.RNT Trizol ilə çıxarıldı və RT-qPCR ilə təyin edildi.Primerlər Əlavə Cədvəl 5-də təqdim olunur.
In vitro RIP analizi dəyişdirilmiş standart RIP analiz protokoluna uyğun olaraq həyata keçirilib.Cəmi 5 pmol in vitro transkripsiya edilmiş RNT RIP tamponu ilə 1 dəfə seyreltildi və 65°C-də 5 dəqiqə inkubasiya yolu ilə tavlandı, sonra otaq temperaturuna qədər yavaş soyudu.Ümumilikdə 5 pmol bütöv və ya mutasiyaya uğramış bayraq etiketli PACT zülalları E. coli-dən təmizləndi.Renaturasiya edilmiş RNT ilə 4°C-də 2 saat inkubasiya edin və bayraq əleyhinə İP üçün RİP analizi üçün yuxarıdakı prosedura əməl edin.
RNT uzadılması analizi üçün 1x107 hüceyrə 1xRIP tamponu ilə parçalandı.4°C-də 13000 rpm-də 15 dəqiqə santrifüjdən sonra supernatant 4°C-də 2 saat ərzində 30 μl streptavidin maqnit muncuqları (Beckman) ilə əvvəlcədən müalicə olundu.Təmizlənmiş lizat daha sonra maya tRNT ilə təmin edildi və 4°C-də gecə ərzində 40 pmol renaturasiya edilmiş RNT ilə inkubasiya edildi, sonra daha 2 saat və BSA ilə bloklanmış 20 μl yeni streptavidin maqnit muncuqları əlavə edildi.Yuma mərhələsi 5x RIP buferi ilə 4 dəfə və 1x RIP buferi ilə 4 dəfədən ibarət idi.Müvafiq zülallar biotin elüsyon tamponu (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ilə yuyuldu və NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) üzərində ayrıldı.Gümüşlə boyandıqdan sonra (Beyotime Biotechnology), müəyyən bantlar eksize edildi və MS tərəfindən təhlil edildi.
PACT və PKR arasında qarşılıqlı əlaqəni yoxlamaq üçün Co-IP təhlili aparıldı.Qısaca, supernatant lizatlar 1 x RIP tamponunda 1 x 107 parçalanmış hüceyrənin inkubasiyası və ardınca 4°C-də 13000 rpm-də 15 dəqiqə sentrifuqalanması ilə hazırlanmışdır.Lizatlar protein A + G maqnit muncuqları ilə yükləndi, 5 µg anti-PACT antikoru ilə birləşdirildi və gecə ərzində 4 ° C-də yumşaq bir şəkildə döndürüldü.Muncuqlar 3 dəfə 5×RIP tamponu ilə, iki dəfə 1×RIP tamponu ilə yuyulmuş və 1×SDS tamponu ilə yuyulmuşdur.Bərpa edilmiş zülal SDS-PAGE geli ilə təhlil edilmiş və DB tərəfindən aşkar edilmişdir.
İki pmol bayraqlı PACT və 1 pmol PKR E. coli-dən təmizləndi.1x RIP buferində durulayın və 4 °C-də 2 saat ərzində 10 pmol renaturasiya edilmiş RNT ilə inkubasiya edin.Bundan sonra, onlar əlavə iki saat zülal A+G maqnit muncuqla birləşdirilmiş anti-etiketli antikor ilə inkubasiya edildi.Muncuqlar daha sonra 1x RIP tamponu ilə dörd dəfə yuyuldu və 1x SDS tamponu ilə yuyuldu.Nəticədə PACT və PKR DB tərəfindən aşkar edilmişdir.