Xəbərlər

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
Aktivləşdirilmiş efirlərə və ya fenoksi radikallarına əsaslanan enzimatik yaxınlıq etiketləmə üsulları canlı hüceyrələrdə subcellular proteomların və zülal interaktorlarının xəritələşdirilməsi üçün geniş istifadə olunur.Bununla belə, aktivləşdirilmiş efirlər daha az reaktivdir, nəticədə geniş etiket radiusu yaranır və peroksid müalicəsi nəticəsində yaranan fenoksi radikalları redoks yollarına müdaxilə edə bilər.Burada miniSOG fotosensibilizator zülalını maraq doğuran zülalla genetik olaraq əlaqələndirməklə işlənmiş yaxınlıq etiketindən asılı fotoaktivləşdirmə (PDPL) metodu haqqında məlumat veririk.Mavi işıqla işə salınan və məruz qalma vaxtı ilə idarə olunan təkli oksigen əmələ gəlir və sonra anilin zondu ilə histidin qalıqlarının məkan-zaman olaraq həll edilmiş etiketlənməsinə nail olur.Biz onun yüksək sədaqətini orqanellə spesifik proteom xəritələşdirilməsi vasitəsilə nümayiş etdiririk.PDPL-nin TurboID ilə yan-yana müqayisəsi PDPL-nin daha spesifik və hərtərəfli proteomik əhatəsini göstərir.Sonra, PDPL-ni xəstəliklə əlaqəli transkripsiya koaktivatoru BRD4 və E3 Parkin ligazasına tətbiq etdik və əvvəllər naməlum olan interaktivləri tapdıq.Həddindən artıq ifadə skrininqi ilə Parkin üçün iki naməlum substrat, Ssu72 və SNW1 müəyyən edildi, onların deqradasiyası ubiquitinasiya-proteazom yolu ilə vasitəçilik olunur.
Zülal şəbəkələrinin dəqiq səciyyələndirilməsi bir çox fundamental hüceyrə proseslərinin əsasını təşkil edir.Buna görə də, zülalların qarşılıqlı əlaqəsinin yüksək dəqiqlikli məkan-zaman xəritəsi bioloji yolların, xəstəlik patologiyalarının deşifrə edilməsi və terapevtik məqsədlər üçün bu qarşılıqlı əlaqənin pozulması üçün molekulyar əsas təmin edəcəkdir.Bu məqsədlə canlı hüceyrələrdə və ya toxumalarda müvəqqəti qarşılıqlı əlaqəni aşkar edə bilən üsullar çox arzu edilir.Yaxınlıq Təmizləmə Kütləvi Spektrometriya (AP-MS) tarixən maraq doğuran zülalların (POI) bağlayıcı tərəfdaşlarını müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir.Kəmiyyət proteomikası üsullarının inkişafı ilə AP-MS əsasında zülal şəbəkələrinin ən böyük verilənlər bazası olan Bioplex3.0 yaradılmışdır.AP-MS çox güclü olsa da, iş prosesində hüceyrə lizisi və seyreltmə mərhələləri zəif və keçici bağlanma qarşılıqlı təsirlərə meyllidir və lizizdən əvvəl bölmələrə bölünməyən saxta qarşılıqlı əlaqə cütləri kimi lizizdən sonrakı artefaktları təqdim edir.
Bu problemləri həll etmək üçün çarpaz əlaqə qrupları və enzimatik yaxın etiketləmə (PL) platformaları (məsələn, APEX və BioID)5 olan qeyri-təbii amin turşuları (UAA) hazırlanmışdır.UAA metodu bir çox ssenarilərdə uğurla tətbiq olunsa da və birbaşa zülal yapışdırıcıları haqqında məlumat versə də, UAA yerinin optimallaşdırılması hələ də tələb olunur.Daha da əhəmiyyətlisi, etiketləmə hadisələrinin katalitik tərsinə çevrilməsi olmayan stokiometrik etiketləmə üsuludur.Bunun əksinə olaraq, BioID metodu kimi enzimatik PL üsulları, mühəndis biotin liqazanı POI7-yə birləşdirir, sonradan reaktiv biotinil-AMP ester aralıq məhsulu yaratmaq üçün biotini aktivləşdirir.Beləliklə, ferment proksimal lizin qalıqlarını etiketləyən aktivləşdirilmiş biotin "buludunu" kataliz edir və buraxır.Bununla belə, BioID kifayət qədər etiketli siqnal əldə etmək üçün 12 saatdan çox vaxt tələb edir ki, bu da onun müvəqqəti qətnamə ilə istifadəsini istisna edir.Maya displeyinə əsaslanan istiqamətləndirilmiş təkamüldən istifadə edərək, TurboID daha səmərəli olmaq üçün BioID əsasında hazırlanmışdır, 10 dəqiqə ərzində biotinlə effektiv etiketlənməyə imkan verir və daha dinamik proseslərin öyrənilməsinə imkan verir.TurboID yüksək aktiv olduğundan və endogen biotin səviyyələri aşağı səviyyəli etiketləmə üçün kifayət olduğundan, ekzogen biotinin əlavə edilməsi ilə yüksək təkmilləşdirilmiş və vaxtında etiketləmə tələb olunduqda fon etiketlənməsi potensial problemə çevrilir.Bundan əlavə, aktivləşdirilmiş efirlər zəif reaktivdir (t1/2 ~5 dəq), bu, xüsusilə qonşu zülalların biotin 5 ilə doymasından sonra böyük etiketləmə radiusuna səbəb ola bilər. Başqa bir yanaşmada, mühəndis askorbat peroksidazasının (yəni biotin- fenol radikalları və zülalların bir dəqiqə ərzində etiketlənməsinə imkan verir9,10.APEX subcellular proteomları, membran zülal komplekslərini və sitozolik siqnal zülal komplekslərini müəyyən etmək üçün geniş istifadə olunur11,12.Lakin, yüksək konsentrasiyalarda peroksidlərə olan ehtiyac redoks zülallarına və ya yollarına təsir göstərə bilər. hüceyrə prosesləri.
Beləliklə, hüceyrə yollarını əhəmiyyətli dərəcədə pozmadan yüksək məkan və zaman dəqiqliyi ilə daha reaktiv etiketli radius bastırma növlərini yarada bilən yeni bir üsul mövcud üsullara mühüm əlavə olacaqdır. Reaktiv növlər arasında singlet oksigen qısa müddətə və məhdud diffuziya radiusuna (hüceyrələrdə t1/2 < 0,6 µs)13 görə diqqətimizi cəlb etdi. Reaktiv növlər arasında singlet oksigen qısa müddətə və məhdud diffuziya radiusuna (hüceyrələrdə t1/2 < 0,6 µs)13 görə diqqətimizi cəlb etdi. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни və ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 mks v hüceyrə)13. Aktiv formalar arasında singlet oksigen qısa müddətə və məhdud diffuziya radiusuna (hüceyrələrdə t1/2 < 0,6 µs)13 görə diqqətimizi çəkdi.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 中t1/2 < 0,6 µs 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни və ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 mks v hüceyrə). Aktiv formalar arasında singlet oksigen qısa müddətə və məhdud diffuziya radiusuna (hüceyrələrdə t1/2 < 0,6 μs) görə diqqətimizi cəlb edir.Tək oksigenin metionin, tirozin, histidin və triptofanı təsadüfi oksidləşdirdiyi bildirilmişdir, bu da onu amin və ya tiol əsaslı zondlara qoşulmaq üçün qütb 14,15 edir16,17.Singlet oksigen subcellular kompartment RNT-ni etiketləmək üçün istifadə olunsa da, endogen POI yaxınlıq markerlərinin təyinatının dəyişdirilməsi strategiyaları tədqiq edilməmiş qalır.Burada biz miniSOG fotosensibilizatoru ilə birləşdirilmiş POI-ləri işıqlandırmaq və proksimal qalıqları oksidləşdirmək üçün təkli oksigen əmələ gəlməsini, ardınca kimyəvi zondları oksidləşdirmək üçün amin tərkibli modifikasiyaları işə salmaq üçün mavi işıqdan istifadə etdiyimiz fotoaktivləşdirmədən asılı yaxınlıq etiketi (PDPL) adlı platformanı təqdim edirik. aralıq canlı hüceyrələr..Açıq proteomik iş axınından istifadə edərək etiketin spesifikliyini və müəyyən edilmiş modifikasiya yerlərini artırmaq üçün bir qrup kimyəvi zond testi etdik.PDPL-nin TurboID ilə yan-yana müqayisəsi PDPL-nin daha spesifik və hərtərəfli proteomik əhatəsini göstərir.Biz bu yanaşmanı həm məlum, həm də naməlum zülal şəbəkəsini təsdiqləyən xərçənglə əlaqəli epigenetik tənzimləyici zülal BRD4 və Parkinson xəstəliyi ilə əlaqəli E3 liqaza Parkin üçün bağlayıcı tərəfdaşların subhüceyrəvi proteomun orqanellə spesifik markerlərinə və ümumi proteomun müəyyən edilməsinə tətbiq etdik. qarşılıqlı təsirlər..PDPL-nin böyük protein komplekslərində E3 substratlarını tanımaq qabiliyyəti dolayı bağlayıcıların tanınmasının tələb olunduğu bir vəziyyəti təmsil edir.Ubiquitination-proteasome vasitəçiliyi ilə iki naməlum parkin substratı yerində təsdiq edilmişdir.
Fotodinamik terapiya (PDT)19 və xromofor yardımlı lazer inaktivasiyası (CALI)20, fotosensibilizatorlarla işıq şüalanması təkli oksigen əmələ gətirir, hədəf zülalları təsirsiz hala sala və ya hüceyrə ölümünə səbəb ola bilər.Singlet oksigen nəzəri diffuziya məsafəsi təqribən 70 nm olan yüksək reaktiv maddə olduğundan, fotosensibilizator ətrafında məkan baxımından məhdud oksidləşməni idarə etmək olar.Bu konsepsiyaya əsaslanaraq, canlı hüceyrələrdə protein komplekslərinin yaxın etiketlənməsinə nail olmaq üçün təkli oksigendən istifadə etmək qərarına gəldik.Biz dörd funksiyanı yerinə yetirmək üçün PDPL kemoproteomik yanaşmasını işləyib hazırlamışıq: (1) PL enzimatik yanaşmasına bənzər aktiv təkli oksigenin əmələ gəlməsini kataliz etmək;(2) işığın işə salınması zamanı həll olunan etiketləməni təmin edin;(3) dəyişdirmə yolu ilə (4) Arxa fonu azaltmaq üçün endogen kofaktorlardan (məsələn, biotin) istifadə etməkdən çəkinin və ya hüceyrənin ətraf mühitin stresinə məruz qalmasını minimuma endirmək üçün yüksək dərəcədə narahat edən ekzogen reagentlərdən (məsələn, peroksidlər) istifadə edin.
Fotosensibilizatorları iki kateqoriyaya bölmək olar, o cümlədən kiçik molekulyar çəkili flüoroforlar (məsələn, qızılgül benqal, metilen mavisi)22 və genetik olaraq kodlaşdırılmış kiçik zülallar (məsələn, miniSOG, KillerRed)23.Modul dizayna nail olmaq üçün biz POI24,25-ə fotosensibilizator (PS) zülalları əlavə etməklə birinci nəsil PDPL platformasını inkişaf etdirdik (Şəkil 1a).Mavi işıqla şüalandıqda, təkli oksigen proksimal nukleofil amin turşusu qalıqlarını oksidləşdirir, nəticədə elektrofilik olan və amin zondu nukleofilləri ilə daha sonra reaksiya verə bilən umpolung polaritesi yaranır16,17.Zond LC/MS/MS xarakteristikası üçün klik kimyasına imkan vermək və aşağı çəkmək üçün alkin sapı ilə hazırlanmışdır.
MiniSOG vasitəçiliyi ilə zülal komplekslərinin etiketlənməsinin sxematik təsviri.Mavi işığa məruz qaldıqda, miniSOG-POI ifadə edən hüceyrələr təkli oksigen yaradır, bu da qarşılıqlı zülalları dəyişdirir, lakin bağlayıcı olmayan zülalları deyil.Fotooksidləşmənin aralıq məhsulları kovalent əlavələr yaratmaq üçün amin kimyəvi zondunun relay etiketləri ilə tutulur.Kimya zondundakı alkinil qrupu aşağı açılan və LC-MS/MS kəmiyyəti ilə zənginləşdirmə üçün klik kimyasına imkan verir.b Amin zondlarının kimyəvi quruluşu 1-4.c 1-4 zondlarından istifadə edərək mitoxondrial lokallaşdırılmış miniSOG vasitəçiliyi ilə proteomik markerlərin flüoresan gel analizi və gel densitometriyasına əsaslanan nisbi kəmiyyət.Kimyəvi zondların siqnal-fon nisbəti mavi işıq istisna olmaqla mənfi nəzarət təcrübələri və ya miniSOG ifadəsi olmayan HEK293T hüceyrələrindən istifadə etməklə qiymətləndirilib.n = 2 bioloji müstəqil nümunə.Hər bir nöqtə bioloji replikanı təmsil edir.d Göstərilən PDPL komponentlərinin mövcudluğu və ya olmaması halında optimallaşdırılmış sonda 3 istifadə edərək, PDPL-nin təmsilçi aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi c.n = 3 bioloji müstəqil nümunə.Hər bir nöqtə bioloji replikanı təmsil edir.Mərkəz xətləri və bığlar orta və ± standart sapmanı təmsil edir.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Uzaq qırmızı Si-DMA ləkəsi ilə təkli oksigenin konfokal görüntülənməsi.Ölçək çubuğu: 10 µm.Gel görüntüləmə və konfokal təcrübələr müstəqil olaraq oxşar nəticələrlə ən azı iki dəfə təkrarlandı.
Əvvəlcə HEK293T-də sabit şəkildə ifadə edilən yetkin fotosensibilizatorlar miniSOG26 və KillerRed23-ün kimyəvi zond kimi proteomun propargilamin etiketlənməsinə vasitəçilik etmək qabiliyyətini sınaqdan keçirdik (Əlavə Şəkil 1a).Gel flüoresan analizi göstərdi ki, bütün proteomun etiketlənməsi miniSOG və mavi işıq şüalanması ilə əldə edilib, KillerRed ilə isə heç bir görünən etiketləmə məhsulu müşahidə olunmayıb.Siqnal-fon nisbətini yaxşılaşdırmaq üçün daha sonra anilin (1 və 3), propilamin (2) və ya benzilamin (4) olan bir sıra kimyəvi zondları sınaqdan keçirdik.Biz HEK293T hüceyrələrinin, ehtimal ki, endogen riboflavin fotosensibilizatoru, flavin mononükleotid (FMN) 27 səbəbiylə mavi işıqla müqayisədə daha yüksək fon siqnalına malik olduğunu müşahidə etdik. Anilin əsaslı kimyəvi zondlar 1 və 3 daha yaxşı spesifiklik verdi, HEK293T mitoxondriyada sabit şəkildə miniSOG ifadə etdi, prob 3 üçün siqnalda >8 dəfə artım nümayiş etdirdi, prob 2 isə RNT etiketləmə metodunda istifadə edilən CAP-seq yalnız ~2,5- göstərdi. RNT və zülal arasında fərqli reaktivlik üstünlükləri səbəbindən çox güman ki, siqnal artımı (Şəkil 1b, c). Anilin əsaslı kimyəvi zondlar 1 və 3 daha yaxşı spesifiklik verdi, HEK293T mitoxondriyada sabit şəkildə miniSOG ifadə etdi, prob 3 üçün siqnalda >8 dəfə artım nümayiş etdirdi, prob 2 isə RNT etiketləmə metodunda istifadə edilən CAP-seq yalnız ~2,5- göstərdi. RNT və zülal arasında fərqli reaktivlik üstünlükləri səbəbindən çox güman ki, siqnal artımı (Şəkil 1b, c).Anilin əsaslı kimyəvi zondlar 1 və 3 daha yaxşı spesifiklik nümayiş etdirdi: mitoxondriyada miniSOG-ni sabit şəkildə ifadə edən HEK293T, sonda 3 üçün siqnalda 8 dəfədən çox artım göstərir, prob 2 isə CAP-seq RNT etiketləmə metodunda istifadə olunur, yalnız ehtimal ki, RNT və zülal arasında fərqli reaktivlik üstünlükləri ilə əlaqədar olaraq ~2,5 dəfə siqnal artımını göstərir (Şəkil 1b, c).基于 苯胺 的 的 化学 探针 的 的 的和 更具 更 更 更 更 特异性 特异性 特异性 特异性 线 线 线 线 线 表达 表达 Minisog, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 而 用 用 于 RNA 标记 Kap-Seq 的 探针 探针 2 仅 ~ ~ 探针 探针 ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c＂基于 苯胺 的 的 化学 探针 和 的 的 的 具具 更 更 更 特异性 特异性 特异性 粒体 表达 表达 表达 Minisog, 探针 3 的 信号 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 RNA 标记 Kap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilin əsaslı kimyəvi zondlar 1 və 3 daha yaxşı spesifikliyə malik idi, HEK293T mitoxondriyada sabit şəkildə miniSOG ifadə etdi və 3-cü zond siqnalda 8 dəfədən çox artım göstərdi, CAP-seq RNT etiketləmə metodu üçün 2-ci zond isə yalnız ~2,5 dəfə artım göstərdi.siqnalda, ehtimal ki, RNT və zülal arasında fərqli reaksiya üstünlükləri səbəbindən (Şəkil 1b, c).Bundan əlavə, zond 3 izomerləri və hidrazin zondları (zond 5, 6, 7) sınaqdan keçirildi və bu, 3-cü zondun optimallaşdırılmasını təsdiq etdi (Əlavə Şəkil 1b, c).Eynilə, geldaxili flüoresan analizi digər optimallaşdırılmış eksperimental parametrləri aşkar etdi: şüalanma dalğa uzunluğu (460 nm), kimyəvi zond konsentrasiyası (1 mM) və şüalanma müddəti (20 dəqiqə) (Əlavə Şəkil 2a-c).PDPL protokolunda hər hansı komponentin və ya addımın buraxılması siqnalın arxa plana əhəmiyyətli dərəcədə dəyişməsi ilə nəticələndi (Şəkil 1d).Qeyd etmək lazımdır ki, zülalların etiketlənməsi singlet oksigeni söndürdüyü məlum olan natrium azid və ya troloxun iştirakı ilə əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır.Singlet oksigeni sabitləşdirdiyi məlum olan D2O-nun olması etiketləmə siqnalını gücləndirir.Digər reaktiv oksigen növlərinin etiketlənməyə töhfəsini araşdırmaq üçün müvafiq olaraq hidroksil və superoksid radikal təmizləyiciləri yaratmaq üçün mannitol və C vitamini əlavə edildi, 18, 29, lakin etiketlənməni azaltmaq üçün tapılmadı.H2O2 əlavəsi, lakin işıqlandırma deyil, etiketləmə ilə nəticələnmədi (Əlavə Şəkil 3a).Si-DMA zondları ilə flüoresan təkli oksigen təsviri HEK293T-miniSOG naqilində təkli oksigenin olduğunu təsdiqlədi, lakin orijinal HEK293T telində yox.Bundan əlavə, mitoSOX Red işıqlandırmadan sonra superoksid istehsalını aşkar edə bilmədi (Şəkil 1e və Əlavə Şəkil 3b) 30. Bu məlumatlar təkli oksigenin sonrakı proteomik etiketləmə üçün cavabdeh olan əsas reaktiv oksigen növləri olduğunu qəti şəkildə göstərir.PDPL-nin sitotoksikliyi mavi işıq şüalanması və kimyəvi zondlar daxil olmaqla qiymətləndirildi və əhəmiyyətli sitotoksiklik müşahidə edilmədi (Əlavə Şəkil 4a).
Etiketləmə mexanizmini öyrənmək və LC-MS/MS istifadə edərək zülal komplekslərinin proteomik identifikasiyasına imkan vermək üçün ilk növbədə hansı amin turşularının dəyişdirildiyini və zond etiketlərinin delta kütləsini müəyyən etməliyik.Metionin, histidin, triptofan və tirozinin singlet oksigen14,15 tərəfindən dəyişdirildiyi bildirilmişdir.Biz TOP-ABPP31 iş prosesini MSFragger32 əsasında FragPipe hesablama platforması tərəfindən təmin edilən qərəzsiz açıq axtarışla birləşdiririk.Singletli oksigen modifikasiyası və kimyəvi zond etiketindən sonra, klik kimyası, tərkibində parçalana bilən bağlayıcı olan biotin azaldılması etiketindən istifadə edilərək həyata keçirildi, ardınca neytravidinin uzanması və tripsinin həzmi aparıldı.Hələ də qatranla bağlı olan dəyişdirilmiş peptid LC-MS/MS analizi üçün fotoyarılmışdır (Şəkil 2a və Əlavə Məlumat 1).Siyahıda 50-dən çox peptid xəritəsi (PSM) uyğunluğu ilə proteomda çoxlu sayda dəyişiklik baş verdi (Şəkil 2b).Təəccüblüdür ki, biz yalnız histidinin modifikasiyasını müşahidə etdik, ehtimal ki, oksidləşmiş histidinin digər amin turşularına nisbətən anilin zondlarına qarşı daha yüksək reaktivliyi ilə əlaqədardır.Histidinin təkli oksigenlə oksidləşməsinin nəşr edilmiş mexanizminə əsasən, 21,33 təklif olunan delta-kütləvi strukturu +229 Da iki oksidləşmədən sonra 3-cü probun 2-okso-histidin əlavəsinə uyğundur, +247 Da isə hidroliz məhsuludur. +229 Da (Əlavə Şəkil 5).MS2 spektrinin qiymətləndirilməsi y və b ionlarının əksəriyyətinin, o cümlədən dəyişdirilmiş fraqment ionlarının (y və b) identifikasiyasının yüksək etibarlılığını göstərdi (Şəkil 2c).PDPL ilə dəyişdirilmiş histidinlərin yerli ardıcıllığının kontekst təhlili ±1 mövqelərdə kiçik hidrofobik qalıqlar üçün orta motiv üstünlük təşkil etdiyini ortaya qoydu (Əlavə Şəkil 4b).Orta hesabla, hər zülal üçün 1,4 histidin müəyyən edildi və bu markerlərin yerləri həlledici ilə əlçatan səth sahəsi (SASA) və nisbi həlledici mövcudluğu (RSA) analizi ilə müəyyən edildi (Əlavə Şəkil 4c, d).
MSFragger tərəfindən dəstəklənən FragPipe hesablama platformasından istifadə edərək qalıq seçiciliyi öyrənmək üçün qərəzsiz iş axını.Streptavidin qatranından dəyişdirilmiş peptidlərin fotoyarılmasına imkan vermək üçün Klik kimyasında parçalana bilən bağlayıcılar istifadə olunur.Çoxsaylı dəyişiklikləri, eləcə də müvafiq qalıqları müəyyən etmək üçün açıq axtarışa başlanılıb.b Proteomda baş verən dəyişikliklərin kütləsini təyin edin.PSM-nin peptid xəritəsi.c 3-cü zond ilə dəyişdirilmiş histidin sahələrinin MS2 spektral annotasiyası. Nümunə olaraq, 3-cü zond ilə kovalent reaksiya dəyişdirilmiş amin turşusuna +229.0938 Da əlavə etdi.d PDPL markerlərini yoxlamaq üçün istifadə edilən mutasiya analizi.PRDX3 (H155A, H225A) və PRDX1 (H10A, H81A, H169A) Bayraq əleyhinə aşkarlanması üçün vəhşi tipli plazmidlərlə transfeksiya edilmişdir.e Sintetik peptid 3-cü zondun iştirakı ilə təmizlənmiş miniSOG ilə reaksiyaya girdi və LC-MS spektrində Δm +247 və +229 olan müvafiq məhsullar qeyd edildi.f miniSOG-6xHis-tag və anti-6xHis antikoru ilə modelləşdirilmiş in vitro protein-zülal qarşılıqlı əlaqəsi.İşığa məruz qalma vaxtından asılı olaraq 3-cü zond ilə etiketlənmiş miniSOG-6xHis/anti-6xHis antikor komplekslərinin antibiotiki (streptavidin-HRP) və anti-siçan Qərb ləkəsi analizi.Fərdi zülallar üçün etiketlər müvafiq molekulyar çəkidə ifadə edilir: LC antikor yüngül zənciri, HC antikor ağır zənciri.Bu təcrübələr müstəqil olaraq ən azı iki dəfə oxşar nəticələrlə təkrarlandı.
Etiketləmə sahəsinin biokimyəvi yoxlanılması üçün kütləvi spektrometriya ilə müəyyən edilmiş PRDX3 və PRDX1 histidindən alaninə dəyişdirildi və transfeksiya analizlərində vəhşi tiplə müqayisə edildi.PDPL nəticələri mutasiyanın etiketləməni əhəmiyyətli dərəcədə azaltdığını göstərdi (Şəkil 2d).Bu vaxt, açıq axtarışda müəyyən edilmiş peptid ardıcıllıqları sintez edilmiş və LC-MS tərəfindən aşkar edildikdə, +247 və +229 Da kütləvi yerdəyişmə ilə məhsullar verən 3-cü zond və mavi işığın iştirakı ilə təmizlənmiş miniSOG ilə in vitro reaksiyaya məruz qalmışdır (Şəkil 2). 2e).).Qarşılıqlı təsir göstərən proksimal zülalların miniSOG fotoaktivləşməsinə cavab olaraq in vitro etiketli olub-olmadığını yoxlamaq üçün biz miniSOG-6xHis zülalı və anti-Onun monoklonal antikoru arasında qarşılıqlı əlaqə ilə süni yaxınlıq analizi hazırladıq (Şəkil 2f).Bu analizdə biz miniSOG ilə ağır və yüngül antikor zəncirlərinin proksimal etiketlənməsini gözlədik.Əslində, anti-siçan (anti-6xHis etiketli antikorun ağır və yüngül zəncirlərini tanıyaraq) və streptavidin Qərb ləkələri ağır və yüngül zəncirlərin güclü biotinilasiyasını göstərdi.Xüsusilə, 6xHis etiketi və yüngül və ağır zəncirlər arasında çarpaz bağlantılar səbəbindən miniSOG avtobiotinilasiyasını qeyd etdik ki, bu da lizin və 2-okso-histidin proksimal reaksiyası arasında əvvəllər təsvir edilmiş boşluqla əlaqəli ola bilər.Nəticə olaraq, PDPL-nin histidini yaxınlıqdan asılı olaraq dəyişdirdiyi qənaətinə gəlirik.
Növbəti məqsədimiz in situ etiketləmənin spesifikliyini yoxlamaq üçün hüceyrəaltı proteomu xarakterizə etmək idi.Buna görə də, HEK293T hüceyrələrinin nüvəsində, mitoxondrial matrisində və ya xarici ER membranında miniSOG-ni sabit şəkildə ifadə etdik (Şəkil 3a).Gel flüoresan analizi üç hüceyrəaltı yerlərdə bol etiketli lentləri, eləcə də müxtəlif etiketləmə nümunələrini aşkar etdi (Şəkil 3b).Floresan görüntüləmə analizi PDPL-nin yüksək spesifikliyini göstərdi (Şəkil 3c).PDPL iş prosesini flüoresan mikroskopiyadan istifadə edərək subhüceyrəvi proteomları təsvir etmək üçün rodamin boyaları ilə klik reaksiyaları izlədi və PDPL siqnalları PDPL-nin yüksək sədaqətini təsdiqləyən DAPI, mitoxondrial izləyicilər və ya ER izləyiciləri ilə birgə lokallaşdırıldı.Üç orqanoid yeri üçün, avidin western blot istifadə edərək PDPL-nin TurboID ilə yan-yana müqayisəsi göstərdi ki, PDPL onların müvafiq nəzarətləri ilə müqayisədə daha dəqiq etiketlənib.PDPL şəraitində, daha çox PDPL etiketli zülalları göstərən daha çox etiketli lentlər meydana çıxdı (Əlavə Şəkil 6a-d).
miniSOG vasitəçiliyi ilə orqanellə spesifik proteomun etiketlənməsinin sxematik təsviri.miniSOG insan COX4-ün N-terminal 23 amin turşusuna (mito-miniSOG), nüvəni H2B-yə (nüvə-miniSOG) və ER membranının sitoplazmik tərəfi (ER-miniSOG) vasitəsilə Sec61β ilə birləşmə yolu ilə mitoxondrial matrisi hədəfləyir. ).Göstərişlərə gel təsviri, konfokal görüntüləmə və kütləvi spektrometriya daxildir.b Üç orqanellə spesifik PDPL profilinin reprezentativ gel şəkilləri.CBB Coomassie Brilliant Blue.c V5 (qırmızı) etiketli antikor tərəfindən aşkar edilən müxtəlif subcellular lokalizasiyaları ilə miniSOG-ni sabit şəkildə ifadə edən HEK293T hüceyrələrinin nümayəndəsi konfokal şəkilləri.Hüceyrəaltı markerlər mitoxondriya və ER (yaşıl) üçün istifadə olunur.PDPL iş axınına Cy3-azid klik kimyasından istifadə edərək miniSOG (sarı) etiketli hüceyrəaltı proteomların aşkarlanması daxildir.Ölçək çubuğu: 10 µm.d Etiketsiz kəmiyyətlə ölçülən müxtəlif orqanellərdə PDPL işarəli proteomların vulkanik planları (n = 3 müstəqil bioloji təcrübə).İki quyruqlu Tələbənin t-testi vulkan sahələrində istifadə edilmişdir.HEK293T vəhşi növü mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və >2 qat ion intensivliyi fərqi). Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və >2 qat ion intensivliyi fərqi). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 və >2-кратная разница в интенсивности ионов). Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və ion intensivliyində >2 qat fərq).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və > ion gücündə 2 qat fərq).HEK293T-miniSOG üçün vacib olan, lakin HEK293T üçün vacib olmayan əlaqəli zülallar yaşıl rənglə göstərilir.e Təcrübələrdən proteomik məlumat dəstlərinin spesifikliyinin təhlili d.Hər bir orqanoiddəki statistik əhəmiyyətli zülalların ümumi sayı (qırmızı və yaşıl nöqtələr) yuxarıda qeyd olunur.Histoqramlar MitoCarta 3.0, GO analizi və A. Ting et al əsasında orqanellələrdə lokallaşdırılmış zülalları göstərir.Xalq.Mitoxondriya, nüvələr və ER üçün ayrı məlumat dəstləri.Bu təcrübələr müstəqil olaraq ən azı iki dəfə oxşar nəticələrlə təkrarlandı.Xam məlumatlar xam məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Gel və görüntüləmə nəticələri ilə həvəsləndirilərək, hər bir orqanoiddə müəyyən edilmiş proteomun kəmiyyətini müəyyən etmək üçün etiketsiz kəmiyyətləşdirmə istifadə edilmişdir (Əlavə Məlumat 2).Transfeksiya edilməmiş HEK293T fon markerlərini çıxarmaq üçün mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Vulkan süjetinin təhlili əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş zülalları (p <0,05 və >2 qat ion intensivliyi) və həmçinin yalnız miniSOG-ifadə edən xətlərdə mövcud olan təkton zülallarını göstərdi (Şəkil 3d qırmızı və yaşıl nöqtələr). Vulkan süjetinin təhlili əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş zülalları (p <0,05 və >2 qat ion intensivliyi) və həmçinin yalnız miniSOG-ifadə edən xətlərdə mövcud olan təkton zülallarını göstərdi (Şəkil 3d qırmızı və yaşıl nöqtələr). Analiz qrafika vulka pokazal znachitelno obagaschennыe belki (p <0, 05 və > 2-kratnaya intensiv ionov), və eyni zamanda odinochnыe belki, kotorыe qəbulu tamamilə bütün liniyah, ekspressiruyuschik miniSOG (ris. kran) var. Vulkan süjetinin təhlili əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş zülalları (p<0,05 və >2 qat ion intensivliyi) və yalnız miniSOG-ifadə edən xətlərdə mövcud olan tək zülalları göstərdi (Şəkil 3d, qırmızı və yaşıl nöqtələr).火山图 分析 显示 出 出 显着 富集 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度) 以及 仅 存 在于 Minisog 表达 系 系 中 的 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 (图 3D 红色 和 蛋白质).火山图 分析 显示 出 出 的 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 强度) 仅 存 在于 在于 Minisog 表达 系 系 的 单一 (图 3D 红色 绿色点 ...)))))))))))))))))) Analiz qrafika vulkan vyyavil znachitelno obagaschennыe belki (p <0, 05 i> 2x ionnaya сила), və eyni zamanda otdelnıe belki, prisutstvuyuschie tolko в экспрессионной линии miniSOG (krasnye i zelenıe tochki na ris. 3d). Vulkan süjetinin təhlili əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş zülalları (p<0.05 və >2x ion gücü), eləcə də yalnız miniSOG ifadə xəttində mövcud olan tək zülalları aşkar etdi (Şəkil 3d-də qırmızı və yaşıl nöqtələr).Bu məlumatları birləşdirərək, müvafiq olaraq 1364, 461 və 911 statistik əhəmiyyətli nüvə, mitoxondrial və ER xarici membran zülallarını müəyyən etdik.Orqanellə lokallaşdırılmış PDPL-nin düzgünlüyünü təhlil etmək üçün biz MitoCarta 3.0, Gen Ontology (GO) analizindən və A. Ting et al.73.4, 78.5 və 73.0% dəqiqliyə uyğun gələn aşkar edilmiş zülalların orqanel spesifikliyini yoxlamaq üçün mitoxondriya, nüvə və ER üçün məlumat dəsti8 istifadə edilmişdir (Şəkil 3e).PDPL-nin spesifikliyi PDPL-nin orqanellə spesifik proteomları müəyyən etmək üçün ideal bir vasitə olduğunu təsdiqləyir.Xüsusilə, müəyyən edilmiş mitoxondrial zülalların submitoxondrial təhlili göstərdi ki, tutulmuş proteom əsasən matrisdə və daxili membranda paylanıb (müvafiq olaraq 226 və 106), müəyyən edilmiş mitoxondrial zülalların ümumi sayının 91,7%-ni (362) təşkil edir.yüksək səviyyəli PDPL əlavə olaraq təsdiqləndi (Əlavə Şəkil 7a).Eynilə, subnüvə analizi, tutulan proteomun əsasən nüvədə, nukleoplazmada və nüvədə paylandığını göstərdi (Əlavə Şəkil 7b).Nüvə lokalizasiyası siqnal peptidi (3xNLS) ilə nüvə proteomik analizi H2B konstruksiyasına oxşar dəqiqlik göstərdi (Əlavə Şəkil 7c-h).PDPL markerinin spesifikliyini müəyyən etmək üçün nüvə laminin A daha diskret lokallaşdırılmış POI7 tələsi kimi seçilmişdir.PDPL əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş 36 zülal müəyyən etdi, bunlardan 12 zülal (30,0% lamin A daxil olmaqla) BioID metodundan (122 zülal) daha yüksək faizlə, yaxşı xarakterizə edilən lamin A qarşılıqlı zülalları idi. 28/28. %) 7. Metodumuz daha az zülal müəyyən etdi, ola bilsin ki, daha aktiv singlet oksigen sayəsində mümkün olan məhdud etiketləmə sahələrinə görə.GO analizi göstərdi ki, müəyyən edilmiş zülallar əsasən nukleoplazmada (26), nüvə membranında (10), nüvə membranında (9) və nüvə məsamələrində (5) yerləşir.Kollektiv olaraq, bu nüvə lokallaşdırılmış zülallar zənginləşdirilmiş zülalların 80% -ni təşkil edərək, PDPL-nin spesifikliyini daha da nümayiş etdirir (Əlavə Şəkil 8a-d).
PDPL-nin orqanoidlərdə yaxınlıq işarələməsini yerinə yetirmək qabiliyyətini müəyyən etdikdən sonra biz PDPL-nin POI bağlayan tərəfdaşları təhlil etmək üçün istifadə oluna biləcəyini yoxladıq.Xüsusilə, yüksək dinamik təbiətinə görə membran lokallaşdırılmış həmkarlarından daha çətin hədəflər hesab edilən sitozolik zülalların PDPL analizini müəyyənləşdirməyə çalışdıq.Bromodomain və ekstraterminal (BET) zülalı BRD4 müxtəlif xəstəliklərdə əsas rolu ilə diqqətimizi cəlb etmişdir 35, 36 .BRD4 tərəfindən yaradılmış kompleks transkripsiya koaktivatoru və mühüm terapevtik hədəfdir.c-myc və Wnt5a transkripsiya faktorlarının ifadəsini tənzimləməklə, BRD4-ün kəskin miyeloid lösemi (AML), çoxsaylı miyeloma, Burkitt lenfoması, kolon xərçəngi və iltihabi xəstəliklərin əsas determinantı olduğu düşünülür37,38.Bundan əlavə, bəzi viruslar papillomavirus, HİV və SARS-CoV-236,39 kimi viral və hüceyrə transkripsiyasını tənzimləmək üçün BRD4-ü hədəfləyir.
PDPL-dən istifadə edərək BRD4 qarşılıqlı əlaqəsinin xəritəsini çəkmək üçün biz miniSOG-ni BRD4-ün qısa N- və ya C-terminal izoforması ilə birləşdirdik.Proteomik nəticələr iki konstruksiya arasında yüksək dərəcədə üst-üstə düşmə aşkar etdi (Əlavə Şəkil 9a).miniSOG-H2B ilə müəyyən edilmiş nüvə proteomu BRD4 ilə qarşılıqlı əlaqədə olan zülalların 77,6%-ni əhatə edir (Əlavə Şəkil 9b).Sonra, marker radiusunu tənzimləmək üçün müxtəlif işıqlandırma vaxtlarından (2, 5, 10, 20 dəq) istifadə edilmişdir (Şəkil 4a və əlavə məlumatlar 3).Belə nəticəyə gəldik ki, daha qısa fotoperiodlarda PDPL ilk növbədə birbaşa bağlayıcı partnyorları etiketləyəcək, daha uzun müddətlərə isə daha qısa fotoaktivləşdirmə dövrlərində müəyyən edilmiş zülallar, eləcə də etiketləmə komplekslərində dolayı hədəflər daxil olacaq.Əslində, biz qonşu vaxt nöqtələri arasında güclü üst-üstə düşmə tapdıq (2 və 5 dəqiqə üçün 84,6%; 5 və 10 dəqiqə üçün 87,7%; 10 və 20 dəqiqə üçün 98,7%) (Şəkil 4b və Əlavə Şəkil 9c).Bütün eksperimental qruplarda biz təkcə BRD4 özünü etiketləməsini deyil, həm də simli verilənlər bazasında qeyd edilmiş MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A və HMGB1 kimi bir neçə məlum hədəfi tapdıq.Bu hədəflərin ion gücü məruz qalma vaxtı ilə mütənasibdir (Şəkil 4c və Əlavə Şəkil 9d).2 dəqiqəlik qrupda müəyyən edilmiş zülalların GO analizi müəyyən edilmiş zülalların nüvədə lokallaşdırıldığını və xromatinin yenidən qurulmasında və RNT polimeraza funksiyasında iştirak etdiyini göstərdi.Zülalın molekulyar funksiyası BRD4 funksiyasına uyğun olaraq xromatinin bağlanması və ya transkripsiya koaktivasiyası ilə zənginləşdirilmişdir (Şəkil 4d).Simli verilənlər bazası ilə işləyən zülal qarşılıqlı təsir təhlili, BRD4 və HDAC bağlayan asetilləşdirilmiş histonlara uyğun olaraq SIN3A, NCOR2, BCOR və SAP130 (Şəkil 4e və Əlavə Şəkil 9e) kimi BRD4 və HDAC ailəsi ilə qarşılıqlı təsir göstərən komplekslər arasında dolayı qarşılıqlı təsirlərin birinci səviyyəsini aşkar etdi. ..Bundan əlavə, Sin3A, NSUN2, Fus və SFPQ daxil olmaqla LC-MS/MS tərəfindən müəyyən edilmiş nümayəndəli hədəflər Western blotting ilə təsdiq edilmişdir (Şəkil 4f).Bu yaxınlarda BRD4-ün qısa izoformunun maye-maye faza ayrılması (LLPS) xüsusiyyətlərinə malik nüvələr əmələ gətirdiyi bildirilmişdir.RNT bağlayıcı zülallar Fus və SFPQ müxtəlif hüceyrə proseslərinin LLPS-inə vasitəçilik edir və burada qeydə alınmamış BRD4 bağlayan zülallar kimi müəyyən edilmişdir.BRD4 və SFPQ arasındakı qarşılıqlı əlaqə, əlavə tədqiqata layiq olan BRD4 vasitəçiliyi ilə maye-maye faza ayrılması üçün başqa bir mexanizm təklif edən ko-immunoprecipitation (co-IP) təcrübələri (Şəkil 4g) ilə təsdiq edilmişdir.Birlikdə götürdükdə, bu nəticələr PDPL-nin məlum BRD4 qarşılıqlı təsirini, eləcə də naməlum bağlayıcı zülalları müəyyən etmək üçün ideal platforma olduğunu göstərir.
miniSOG vasitəçiliyi ilə BRD4 yaxınlıq işarələməsinin sxematik təsviri, məruz qalma vaxtları: 2, 5, 10 və 20 dəq.b Müxtəlif işıqlandırma vaxtlarında müəyyən edilmiş zülalların üst-üstə düşməsi.HEK293T-miniSOG-BRD4-də müəyyən edilmiş zülal zənginləşdirilməsi yabanı tipli HEK293T ilə müqayisədə statistik cəhətdən əhəmiyyətli idi.c Müəyyən edilmiş ekspozisiya vaxtı ərzində etiketlənməmiş təmsilçi məlum BRD4 bağlayan zülalların miqdarını təyin edərkən ion intensivliyi.n = 3 bioloji müstəqil nümunə.Məlumatlar orta ± standart sapma kimi təqdim olunur.d 2 dəqiqəlik qrupda müəyyən edilmiş zülalların gen ontoloji analizi (GO).İlk on GO şərtləri sadalanır.Baloncuklar GO termini kateqoriyasına görə rənglənir və qabarcıq ölçüsü hər termində tapılan zülalların sayına mütənasibdir.e BRD4 ilə qarşılıqlı əlaqədə olan zülalların simli analizi.Sarı dairələr birbaşa yapışqandır və boz dairələr dolayı yapışqanın birinci təbəqəsidir.Qırmızı xətlər eksperimental olaraq müəyyən edilmiş qarşılıqlı əlaqələri, mavi xətlər isə proqnozlaşdırılan qarşılıqlı əlaqəni təmsil edir.f LC-MS/MS-də müəyyən edilmiş Nümayəndə BRD4 bağlama hədəfləri Western blotting ilə təsdiq edilmişdir.g Co-immunoprecipitation təcrübələri SFPQ və BRD4 arasında qarşılıqlı əlaqəni təsdiqləyir.Bu təcrübələr müstəqil olaraq ən azı iki dəfə oxşar nəticələrlə təkrarlandı.Xam məlumatlar xam məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Qeydə alınmamış POI ilə əlaqəli hədəfləri müəyyən etməklə yanaşı, biz fərz edirik ki, PDPL fermentlər üçün substratların müəyyən edilməsi üçün uyğun olacaq və bu, qeydiyyatdan keçməmiş substratlara şərh vermək üçün böyük komplekslərdə dolayı bağlayıcı zülalların xarakteristikasını tələb edəcək.Parkin (PARK2 tərəfindən kodlanır) E3 liqazdır və parkin mutasiyalarının autosomal resessiv yetkinlik yaşına çatmayan Parkinson xəstəliyinə (AR-JP) səbəb olduğu bilinir42.Bundan əlavə, parkin mitofagiya (mitoxondrial otofagiya) və reaktiv oksigen növlərinin çıxarılması üçün zəruri olaraq təsvir edilmişdir.Bununla belə, bir neçə parkin substratı müəyyən edilsə də, bu xəstəlikdə parkinin rolu qeyri-müəyyən olaraq qalır.Xaraktersiz substratlara şərh vermək üçün PDPL parkinin N- və ya C-terminusuna miniSOG əlavə etməklə sınaqdan keçirilmişdir.Hüceyrələr PINK1-Parkin yolu ilə parkini aktivləşdirmək üçün karbonil siyanid proton daşıyıcısı m-xlorofenilhidrazon (CCCP) ilə müalicə edildi.BRD4 PDPL nəticələrimizlə müqayisədə, parkin N-terminus füzyonu C-terminusunun daha böyük bir hissəsini (210-dan 177) əhatə etsə də, daha böyük hədəf zülallar dəstini aşkar etdi (Şəkil 5a,b və Əlavə Məlumat 4).nəticə N-terminal teqlərinin Parkin44-ü anormal şəkildə aktivləşdirə biləcəyinə dair hesabatlara uyğundur.Təəccüblüdür ki, məlumatlarımızda Parkin43 üçün dərc edilmiş AP-MS nəticələri ilə üst-üstə düşən yalnız 18 zülal var idi, ehtimal ki, hüceyrə xətləri və proteomik iş axınları arasındakı fərqlər səbəbindən.İki üsulla müəyyən edilmiş dörd məlum zülaldan əlavə (ARDM1, HSPA8, PSMD14 və PSMC3) (Şəkil 5c)43.LC-MS/MS nəticələrini daha da təsdiqləmək üçün HEK293T ana hüceyrə analizinin və sabit N-terminal parkin xəttinin nəticələrini müqayisə etmək üçün PDPL müalicəsi və sonrakı Western blotting istifadə edilmişdir.Əvvəllər naməlum hədəflər CDK2, DUT, CTBP1 və PSMC4 məlum bağlayıcı DNAJB1 ilə sınaqdan keçirilmişdir (Şəkil 5d).
HEK293T hüceyrələrində parkinlə qarşılıqlı təsir göstərən zülalların vulkan süjeti, parkinin N- və ya C-terminusuna birləşmiş sabit şəkildə ifadə edilmiş miniSOG ilə (n = 3 müstəqil bioloji təcrübə).İki quyruqlu Tələbənin t-testi vulkan sahələrində istifadə edilmişdir.HEK293T mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və >2 qat ion intensivliyi fərqi). Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və >2 qat ion intensivliyi fərqi). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 və >2-кратная разница в интенсивности ионов). Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və ion intensivliyində >2 qat fərq).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş zülallar qırmızı rənglə vurğulanır (p <0,05 və > ion gücündə 2 qat fərq).HEK293T-miniSOG üçün vacib olan, lakin HEK293T üçün vacib olmayan əlaqəli zülallar yaşıl rənglə göstərilir.b N-terminal və C-terminal konstruksiyaları arasında üst-üstə düşən zülalları göstərən Venn diaqramı.N-terminal etiketləri parkini anormal şəkildə aktivləşdirə və daha çox tanınan zülallara səbəb ola bilər.c PDPL və AP-MS arasında üst-üstə düşən zülalları göstərən Venn diaqramı.PDPL-də xüsusi olaraq müəyyən edilmiş 18 üst-üstə düşən zülaldan 4-ü və 159 zülaldan 11-i daxil olmaqla məlum interaktorlar siyahıya alınmışdır.d LC-MS/MS tərəfindən müəyyən edilmiş nümayəndə hədəfləri Western blotting ilə təsdiq edilmişdir.e Ssu72 və SNW1 qeydiyyatdan keçməmiş parkin substratları kimi müəyyən edilmişdir.Bu FLAG etiketli zülal plazmidləri HEK293T və HEK293T-Parkin-miniSOG-ə transfeksiya edildi, sonra müxtəlif vaxt nöqtələrində CCCP müalicəsi aparıldı.Deqradasiya daha çox Parkin həddindən artıq ifadə xəttində özünü göstərdi.f MG132 proteazom inhibitorundan istifadə edərək, Ssu72 və SNW1-in deqradasiya prosesinin proteazom-ubiquitination vasitəsilə vasitəçilik edildiyi təsdiqləndi.Bu təcrübələr müstəqil olaraq ən azı iki dəfə oxşar nəticələrlə təkrarlandı.Xam məlumatlar xam məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Qeyd etmək lazımdır ki, PDPL tərəfindən müəyyən edilmiş zülallar parkin bağlayıcı zülalları və onların substratlarını əhatə etməlidir.Qeydə alınmamış parkin substratlarını aşkar etmək üçün biz yeddi müəyyən edilmiş zülal (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 və SNW1) və transfeksiya edilmiş plazmidləri seçdik ki, bu genləri normal HEK293T-yə məruz qoyduq və miniSOG-Parkin-in HEK293CCP ilə müalicəsini stabil şəkildə ifadə etdik.Sabit miniSOG-Parkin xəttində Ssu72 və SNW1 zülallarının səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil 5e).12 saat ərzində CCCP ilə müalicə hər iki substratın ən əhəmiyyətli deqradasiyası ilə nəticələndi.Ssu72 və SNW1-in deqradasiyasının proteazom-ubiquitination ilə tənzimlənib-tənzimlənilmədiyini araşdırmaq üçün proteazomun fəaliyyətini maneə törətmək üçün MG132 proteazom inhibitoru əlavə edildi və əslində onların deqradasiya prosesinin maneə törədildiyini aşkar etdik (Şəkil 5f).Əlavə qeyri-substrat hədəflər, LC-MS/MS ilə ardıcıl nəticələr göstərən Western blotting istifadə edərək Parkin interaktorları kimi təsdiqləndi (Əlavə Şəkil 10).Nəticə olaraq, PDPL iş axınının hədəf zülal transfeksiyasının yoxlanılması ilə inteqrasiyası qeydiyyatdan keçməmiş E3 ligaza substratlarını müəyyən etməyə imkan verir.
Biz kosmosda və zamanda qarşılıqlı əlaqədə olan POI-ləri müəyyən etməyə imkan verən ümumi yaxınlıq işarələmə platforması hazırlamışıq.Platforma miniSOG fotosensibilizator zülalına əsaslanır ki, bu da cəmi 12 kDa, yetkin APEX2 fermentinin (27 kDa) yarısından az və TurboID-in (35 kDa) üçdə bir hissəsidir.Daha kiçik ölçü, kiçik protein interaktomlarının öyrənilməsi üçün tətbiq sahələrini əhəmiyyətli dərəcədə genişləndirməlidir.Singlet oksigenin kvant məhsuldarlığını artırmaq və bu yanaşmanın həssaslığını genişləndirmək üçün genetik olaraq kodlanmış zülallar və ya kiçik molekullar olsun, əlavə fotosensibilizatorların əlavə tədqiqinə ehtiyac var.MiniSOG-un cari versiyası üçün yaxınlıq markerlərini aktivləşdirmək üçün mavi işıqlandırmadan istifadə edərək yüksək temporal ayırdetmə əldə edilə bilər.Bundan əlavə, daha uzun ekspozisiya müddəti daha çox distal histidin qalıqlarının modifikasiyasına, etiketləmə radiusunun artmasına və PDPL məkan qətnaməsini dəqiq tənzimləmək qabiliyyətinə səbəb olan daha böyük təkli oksigen "buludunu" buraxdı.Biz həmçinin siqnal-fon nisbətini artırmaq üçün yeddi kimyəvi zond sınaqdan keçirdik və bu yanaşmanın arxasındakı molekulyar mexanizmi araşdırdıq.Qərəzsiz açıq axtarışla birləşən TOP-ABPP iş prosesi təsdiq etdi ki, dəyişikliklər yalnız histidinlərdə baş verib və loop bölgəsində histidinlərə orta üstünlük istisna olmaqla, histidin modifikasiyalarının artması üçün heç bir ardıcıl mikromühit müşahidə olunmayıb.
PDPL həmçinin proteom spesifikliyi və əhatə dairəsi ilə subhüceyrəvi proteomları xarakterizə etmək üçün ən azı digər yaxınlıq etiketləməsi və orqanellə spesifik kimyəvi zond metodları ilə müqayisə edilə bilən şəkildə istifadə edilmişdir.Səthi, lizosomal və sekretomla əlaqəli proteomları xarakterizə etmək üçün yaxınlıq markerləri də uğurla istifadə edilmişdir46,47.PDPL-nin bu hüceyrəaltı orqanellələrə uyğun olacağına inanırıq.Bundan əlavə, dinamik xüsusiyyətlərinə və daha çox müvəqqəti qarşılıqlı əlaqədə iştirakına görə membrana bağlı zülallardan daha mürəkkəb olan sitozolik zülalların bağlanması üçün hədəfləri müəyyən edərək PDPL-ə etiraz etdik.PDPL iki zülala, transkripsiya koaktivatoru BRD4 və xəstəliklə əlaqəli E3 Parkin ligazasına tətbiq edilmişdir.Bu iki zülal təkcə fundamental bioloji funksiyalarına görə deyil, həm də klinik əhəmiyyətinə və terapevtik potensialına görə seçilmişdir.Bu iki POI üçün tanınmış məcburi tərəfdaşlar, eləcə də qeydiyyatdan keçməmiş hədəflər müəyyən edilmişdir.Xüsusilə, faza ayrılması ilə əlaqəli protein SFPQ, BRD4 (qısa izoform) LLPS-i tənzimləyən yeni bir mexanizm göstərə bilən ko-IP tərəfindən təsdiq edilmişdir.Eyni zamanda, biz hesab edirik ki, Parkin substratlarının identifikasiyası dolayı yapışdırıcıların müəyyən edilməsinin tələb olunduğu bir ssenaridir.Biz iki naməlum parkin substratını müəyyən etdik və onların ubiquitination-proteasome yolu boyunca deqradasiyasını təsdiqlədik.Bu yaxınlarda hidrolaza substratlarını fermentlərlə tutaraq aşkar etmək üçün mexanizmə əsaslanan tutma strategiyası hazırlanmışdır.Bu çox güclü üsul olsa da, böyük komplekslərin əmələ gəlməsində iştirak edən substratların təhlili üçün uyğun deyil və fermentlə substrat arasında kovalent bağların formalaşmasını tələb edir.Biz gözləyirik ki, PDPL deubikitinaz və metalloproteaz ailələri kimi digər protein komplekslərini və ferment ailələrini öyrənmək üçün genişləndirilə bilər.
Təkmilləşdirilmiş oksigen istehsalı ilə SOPP3 adlı yeni miniSOG forması işlənib hazırlanmışdır.Biz miniSOG-ni SOPP3 ilə müqayisə etdik və siqnalın səs-küyə nisbəti dəyişməz qalsa da, yaxşılaşmış işarələmə performansını tapdıq (Əlavə Şəkil 11).Biz fərz etdik ki, SOPP3-ün optimallaşdırılması (məsələn, istiqamətləndirilmiş təkamül yolu ilə) daha qısa işıq vaxtını tələb edən daha səmərəli fotosensibilizasiya zülallarına gətirib çıxaracaq və beləliklə, daha dinamik hüceyrə proseslərini tutmağa imkan verəcək.Qeyd edək ki, PDPL-nin hazırkı versiyası hüceyrə mühiti ilə məhdudlaşır, çünki o, mavi işıq işıqlandırmasını tələb edir və dərin toxumalara nüfuz edə bilmir.Bu xüsusiyyət onun heyvan modeli tədqiqatlarında istifadəsini istisna edir.Bununla belə, optogenetikanın PDPL ilə birləşməsi heyvanlar üzərində, xüsusən də beyində tədqiqat üçün bir fürsət təmin edə bilər.Bundan əlavə, digər mühəndis infraqırmızı fotosensibilizatorlar da bu məhdudiyyəti aradan qaldırır.Hazırda bu sahədə araşdırmalar aparılır.
HEK293T hüceyrə xətti ATCC-dən (CRL-3216) əldə edilmişdir.Hüceyrə xətti mikoplazma infeksiyası üçün neqativ sınandı və 10% fetal iribuynuzlu zərdab (FBS, Vistech, #SE100-B) və 1% penisilin/streptomisin (Hyclone, #SV3001) ilə əlavə edilmiş DMEM (Thermo, #C11995500BT) içində becərildi.-də böyüdü.
3-Aminofenilen (nümunə 3) və (4-etinilfenil)metanamin (nümunə 4) Bidepharm-dan alınıb.Propilamin (zond 2) Energy-chemicals-dan alınıb.N-(2-Aminofenil)pent-4-namid (zond 1) nəşr edilmiş üsullara əsasən sintez edilmişdir.
Əlavə Cədvəl 1 bu işdə istifadə edilən genetik konstruksiyaları sadalayır.MiniSOG və KillerRed sekansları P.Zoudan (Pekin Universiteti) hədiyyə plazmidindən klonlaşdırılıb.Mitoxondrial matris hədəfləmə ardıcıllığı COX4-ün 23 N-terminal amin turşusundan əldə edilmiş və Gibson montajından (Beyotime, #D7010S) istifadə edərək göstərilən vektorlara klonlaşdırılmışdır.Endoplazmik retikulumun membranını və nüvəsini hədəf almaq üçün HEK293T hüceyrələrinin cDNA kitabxanasından PCR ilə gücləndirilmiş SEC61B insan DNT-si (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) və H2B DNT (D. Lin, Shenzhen Bay Laboratoriyası tərəfindən bağışlanmışdır) və yuxarıda qeyd edildiyi kimi klonlanmışdır.Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, sabit hüceyrə xətlərinin transfeksiyası və qurulması üçün istifadə edilən digər protein genləri HEK293T hüceyrə cDNA kitabxanasından PCR gücləndirilmişdir.G3S (GGGS) və G4S (GGGGS) yem zülalı ilə miniSOG arasında bağlayıcı kimi istifadə edilmişdir.Bu birləşmə konstruksiyalarına V5 epitop etiketi (GKPIPNPLLGLDST) əlavə edildi.Məməlilərdə ifadə və sabit hüceyrə xətti yaratmaq üçün miniSOG füzyon konstruksiyası pLX304 lentiviral vektoruna subklonlaşdırıldı.Bakterial ifadə üçün miniSOG C-terminusunda 6xHis etiketli pET21a vektoruna klonlaşdırıldı.
HEK293T hüceyrələri altı quyu boşqablarında hər quyuya 2,0 x 105 hüceyrədə əkilmiş və 24 saat sonra rekombinant lentiviral plazmidlər (2,4 μg pLX304) və viral qablaşdırma plazmidləri (1,5 μg psPAX2 və 1,2 μg MD08yo.02 ilə istifadə etməklə) ilə transfeksiya edilmişdir. , #C0533), təxminən 80% birləşmə.Gecədə transfeksiya edildikdən sonra mühit dəyişdirildi və daha 24 saat inkubasiya edildi.Virusun toplanması 24, 48 və 72 saatdan sonra həyata keçirilib.Hədəf hüceyrə xətlərinin yoluxmasından əvvəl virus mühiti 0,8 μm filtrdən (Merck, #millex-GP) süzüldü və polibrene (Solarbio, #H8761) 8 μg/ml konsentrasiyaya əlavə edildi.24 saatdan sonra mühit dəyişdirilərək hüceyrələrin bərpasına icazə verildi.Hüceyrələr daha aşağı sərt seçim kimi ilk üç keçid üçün 5 μg/ml blastisidin (Solarbio, #3513-03-9) istifadə edilməklə seçilmişdir.Sonra növbəti üç keçid üçün daha sərt rejim kimi 20 μg/ml istifadə olunur.
Hüceyrələr hər quyu üçün təxminən 20,000 hüceyrə sıxlığında 12 quyu kameralarına (Ibidi, #81201) səpildi.HEK293T hüceyrələrinin yapışmasını yaxşılaşdırmaq üçün 37°C-də fosfat tamponlu salin (PBS, Sangon, #B640435) ilə seyreltilmiş 50 µg/ml fibronektin (Corning, #356008) əlavə edin.Kameralar 1 saat əvvəlcədən müalicə olundu və sonra PBS ilə çıxarıldı.24 saatdan sonra hüceyrələr bir dəfə PBS ilə yuyuldu, 1 mM prob 3 ilə təzə Hanksın balanslaşdırılmış duz məhlulunda (HBSS, Gibco, #14025092) 1 saat 37°C-də inkubasiya edildi və sonra mavi LED (460 nm) ilə inkubasiya edildi. ).) otaq temperaturunda 10 dəqiqə şüalandı.Bundan sonra hüceyrələr iki dəfə PBS ilə yuyuldu və otaq temperaturunda 15 dəqiqə ərzində PBS-də (Sangon, # E672002) 4% formaldehidlə sabitləndi.Həddindən artıq formaldehid PBS ilə üç dəfə yuyularaq sabit hüceyrələrdən çıxarıldı.Hüceyrələr daha sonra PBS-də 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) ilə keçiriciləşdirildi və 3 dəfə PBS ilə yuyuldu.Sonra kameranı çıxarın və hər nümunəyə 50 µM Cy3-azid (Ələddin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ehtiva edən 25 µl klik reaksiyası qarışığı əlavə edin. və 0,5 mq/ml natrium askorbat (Ələddin, № S105024) və otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edilmişdir.Sürətli reaksiyadan sonra hüceyrələr altı dəfə 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) olan PBS ilə yuyuldu və sonra otaq temperaturunda 30 dəqiqə PBST-də 5% BSA (Abcone, #B24726) ilə bloklandı.
Kolokalizasiyanın immuno-boyanması üçün hüceyrələr göstərilən şərtlərə uyğun olaraq ilkin antikorlarla inkubasiya edildi: siçan anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), dovşan anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), dovşan poliklonal anti-kalnexin antikoru (1:500, Abcam, #ab22595) və ya dovşan anti-lamin A/C monoklonal antikor (1:500; CST, #2032) gecə ərzində 4 °C-də.PBST ilə 3 dəfə yuyulduqdan sonra hüceyrələr ikincil antikorlarla inkubasiya edildi: keçi anti-dovşan Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000 nisbətində seyreltilmiş, keçi siçan əleyhinə Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:000 nisbətində seyreltilmiş.seyreltmə Otaq temperaturunda 30 dəqiqə seyreltin.Hüceyrələr daha sonra 3 dəfə PBST ilə yuyuldu və otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində PBS-də DAPI (Thermo, # D1306) ilə əks boyadı.PBS ilə 3 dəfə yuyulduqdan sonra hüceyrələr görüntüləmə üçün PBS-də 50% qliserində (Sangon, #A600232) möhürlənmişdir.İmmunofluoresan təsvirlər ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokal mikroskop və ZNE 3.5 proqram təminatı ilə əldə edilmişdir.
Singlet oksigen flüoresan görüntüləmə üçün hüceyrələr Hanks HEPES tamponuna 100 nM Si-DMA əlavə etməzdən əvvəl iki dəfə Hanks HEPES tamponu ilə yuyuldu (DOJINDO, #MT05).İşığa məruz qaldıqdan sonra hüceyrələr CO2 inkubatorunda 37°C-də 45 dəqiqə inkubasiya edildi.Hüceyrələr daha sonra Hanksın HEPES tamponu ilə iki dəfə yuyuldu və otaq temperaturunda 10 dəqiqə Hanksın HEPES tamponunda Hoechst ilə əks rəngləndi və ZEISS LSM 900 konfokal mikroskopundan istifadə edərək görüntüləndi., #M36008) tərkibində kalsium və maqnezium olan HBSS tamponunda.İşığa və ya doksorubisinə (MCE, #HY-15142A) məruz qaldıqdan sonra hüceyrələr CO2 inkubatorunda 37°C-də 10 dəqiqə inkubasiya edildi, iki dəfə HBSS tamponu ilə yuyuldu və otaq temperaturunda HBSS tamponunda Hoechst ilə inkubasiya edildi.dəqiqə.Hüceyrələrin 30 dəqiqə ərzində 1% BSA ehtiva edən HBSS-də 20 μM doksorubisin ilə müalicə olunduğu müsbət prob nəzarəti kimi doksorubisin istifadə edilmişdir.İmmunofluoresan təsvirlər Zeiss LSM 900 konfokal mikroskopundan istifadə etməklə əldə edilmişdir.
Mito-miniSOG-ni sabit şəkildə ifadə edən HEK293T hüceyrələri 15 sm qablarda təxminən 30% sıxlıqda səpildi.48 saat sonra, ~80% birləşmə əldə edildikdə, hüceyrələr bir dəfə PBS ilə yuyuldu, təzə HBSS tamponunda 1 mM Probe 3 ilə 37°C-də 1 saat ərzində inkubasiya edildi və sonra otaqda 10 dəqiqə mavi LED ilə işıqlandırıldı. temperatur..Bundan sonra hüceyrələr iki dəfə PBS ilə yuyuldu, kazındı və EDTA-sız proteaz inhibitorları (MCE, #HY-K0011) olan buz kimi soyuq PBS tamponunda yenidən dayandırıldı.Hüceyrələr ucun ucunu 1 dəqiqə (35% amplitudada 1 saniyə açıq və 1 saniyə söndürmə) sonikasiya etməklə parçalandı.Nəticədə qarışıq zibilləri çıxarmaq üçün 4°C-də 10 dəqiqə ərzində 15,871 xg-də sentrifuqa edildi və supernatant konsentrasiyası BCA protein analiz dəsti (Beyotime, # P0009) istifadə edərək 4 mq/mL-ə düzəldildi.Yuxarıdakı lizatdan 1 ml 0,1 mM fotodeqradasiyaya uğrayan biotin azid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA liqand (Ələddin, #T162437) və 1 m küp kub SO4 ilə birləşdirin. otaq temperaturunda 1 saat fırlanma.Sürətli reaksiyadan sonra qarışığı 10 ml şüşə flakonda əvvəlcədən qarışdırılmış məhlula (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) əlavə edin.Nümunələr qarışdırılmış və otaq temperaturunda 4500 q-da 10 dəqiqə sentrifuqa edilmişdir.Aşağı və yuxarı məhlullar atıldı, çöküntü iki dəfə 1 ml metanol ilə yuyuldu və 4 ° C-də 5 dəqiqə 15871 × g-də sentrifuqa edildi.Çöküntünü həll etmək üçün 25 mM ammonium bikarbonata (ABC, Aladdin, № A110539) 1 ml 8 M karbamid (Ələddin, № U111902) əlavə edin.Nümunələr 55°C-də 40 dəqiqə ərzində 10 mM ditiotreitol (Sangon, #A100281, 25 mM ABC) ilə yenidən quruldu, ardınca qaranlıqda otaq temperaturunda 15 mM təzə yodoasetamid (Sangon, #A600539) əlavə edildi.30 dəqiqə ərzində alkilləşmə..Reaksiyanı dayandırmaq üçün əlavə 5 mM ditiotreitol əlavə edildi.1 ml PBS ilə 3 dəfə yumaqla hər nümunə üçün təxminən 100 µl NeutrAvidin agaroz muncuqları (Thermo, #29202) hazırlayın.Yuxarıdakı proteom məhlulu 5 ml PBS ilə seyreltilmiş və otaq temperaturunda 4 saat əvvəlcədən yuyulmuş NeutrAvidin agaroz muncuqları ilə inkubasiya edilmişdir.Muncuqlar daha sonra 0,2% SDS (Sangon, #A600485) olan 5 ml PBS ilə 3 dəfə, 1M karbamid ehtiva edən 5 ml PBS ilə 3 dəfə və 5 ml ddH2O ilə 3 dəfə yuyuldu.Muncuqlar daha sonra sentrifuqa üsulu ilə yığıldı və tərkibində 1 M karbamid, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) və 20 ng/μl tripsin (Promega, #V5280) olan 200 μl 25 mM ABC-də yenidən dayandırıldı.Fırlanma ilə gecəni 37°C-də tripsizləşdirin.pH 2-3-ə çatana qədər qarışqa turşusu (Thermo, # A117-50) əlavə edilərək reaksiya dayandırıldı.Muncuqlar 0,2% SDS olan 1 ml PBS ilə 3 dəfə, 1 M karbamid tərkibli 1 ml PBS ilə 3 dəfə, sonra isə 1 ml distillə edilmiş su ilə 3 dəfə yuyuldu.Dəyişdirilmiş peptidlər 200 μl 70% MeOH istifadə edərək 90 dəqiqə ərzində yüngül lizis (365 nm) ilə buraxıldı.Santrifüqadan sonra supernatant toplandı.Sonra muncuqlar bir dəfə 100 μl 70% MeOH ilə yuyuldu və supernatantlar birləşdi.Nümunələr Speedvac vakuum konsentratorunda qurudulmuş və analiz edilənə qədər -20°C-də saxlanılmışdır.
Təkli oksigenlə dəyişdirilmiş peptidləri müəyyən etmək və kəmiyyətini müəyyən etmək üçün nümunələr 0,1% qarışqa turşusunda yenidən həll edildi və 1 μg peptidlər Tune-dan nano ESI mənbəyi ilə təchiz edilmiş Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütlə spektrometrindən və satıcı proqram təminatından Xcalibur-dan 4.3 istifadə edərək təhlil edildi.Nümunələr 3 µm C18 materialı (ReproSil-pur, #r13.b9.) ilə 75 µm × 15 sm daxili qablaşdırılan kapilyar sütunda ayrıldı və EASY-nLC 1200 UHPLC sisteminə (Thermo) qoşuldu.Peptidlər xətti 95 dəqiqəlik gradient xromatoqrafiya ilə 8% həlledici B-dən 50% həlledici B-yə (A = suda 0.1% qarışqa turşusu, B = 80% asetonitrildə 0.1% qarışqa turşusu) ayrıldı, sonra xətti olaraq 98% B dəq-a qədər artırıldı. 6 dəqiqə ərzində 300 nl/dəq axın sürətində.Orbitrap Fusion Lumos verilənlərdən asılı olaraq tam MS scan və MS2 scan arasında növbə ilə məlumat toplayır.Püskürtmə gərginliyi 2,1 kV-a təyin edildi və ion nəqli kapilyarının temperaturu 320 ° C idi.MS spektrləri (350-2000 m/z) 120.000, AGC 4 × 105 və maksimum 150 ms giriş vaxtı ilə toplanmışdır.Hər bir tam skanda 10 ən çox yayılmış çoxaldılmış yüklü prekursor 30% normallaşdırılmış toqquşma enerjisi, 1,6 m/z dördqütblü izolyasiya pəncərəsi və 30.000 qətnamə qəbulu ilə HCD istifadə edərək parçalanmışdır.5×104 və maksimum giriş vaxtı 150 ms istifadə edərək tandem kütlə spektrometriyası üçün AGC hədəfi.Dinamik istisna 30 saniyəyə təyin edilmişdir. Təyin edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olanlar MS/MS üçün rədd edildi. Təyin edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olanlar MS/MS üçün rədd edildi. MS/MS üçün 1+ və >7+ ilə nənaznachennıe ion və ya ion ilə şarj. Təyin edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olan ionlar MS/MS üçün rədd edildi.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы və ya ионы с зарядами 1+ və >7+ ilə отклоны üçün MS/MS. Müəyyən edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olan ionlar MS/MS üçün rədd edildi.
Xam məlumatlar MSFragger əsasında FragPipe hesablama platformasından istifadə etməklə işlənir.Kütləvi meyllər və müvafiq amin turşuları -150 ilə 500 Da arasında bir prekursor kütləsinə dözümlülük ilə açıq axtarış alqoritmi ilə müəyyən edilmişdir.Modifikasiya edilmiş peptidlər daha sonra PD-də +229.0964 və +247.1069 Da (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) kütlə artımı ilə histidin modifikasiyalarından istifadə edərək müəyyən edildi.
Birləşdirilmiş miniSOG genini sabit şəkildə ifadə edən hüceyrələr 6 sm qablara qoyuldu.~80% birləşməyə çatdıqdan sonra hüceyrələr bir dəfə HBSS (Gibco, #14025092) ilə yuyuldu, sonra kimyəvi zondlarla HBSS-də 37°C-də 1 saat inkubasiya edildi və mavi işıqla işıqlandırıldı.Otaq temperaturunda 20 dəqiqə 10W LED.PDPL-də hansı növ reaktiv oksigen növlərinin iştirak etdiyini müəyyən etmək üçün 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , Əlavə olaraq hüceyrələrə 100 mM mannitol (Enerji Kimyası, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 əlavə edildi.Soyuq PBS ilə yuyulduqdan sonra hüceyrələr kazındı, 1,5 ml santrifüj borularında toplandı və EDTA olmadan 1x proteaz inhibitoru ilə 200 μl PBS-də (1 s və 1 s olmadan, amplituda 35%) 1 dəqiqə ərzində bir uc ilə sonikasiya edildi.Nəticədə qarışıq 4 °C-də 10 dəqiqə ərzində 15,871 × g-də sentrifuqa edildi və supernatant konsentrasiyası BCA protein analiz dəsti istifadə edərək 1 mq/mL-ə düzəldildi.Yuxarıdakı lizatdan təxminən 50 µl 0,1 mM rodamin azid (Ələddin, № T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA liqand və 1 mM CuSO4 ilə otaq temperaturunda aşağıdan yuxarıya fırlanma ilə 1 saat ərzində inkubasiya edilmişdir.Klik reaksiyasından sonra nümunələrə 250 μl əvvəlcədən soyudulmuş aseton əlavə edilərək, -20°C-də 20 dəqiqə inkubasiya edilərək və 4°C-də 10 dəqiqə ərzində 6010×g-da sentrifuqa edilərək asetonla çökdürmə aparıldı.Qranulları toplayın və 50 µl 1x Laemmli tamponunda 95 °C-də 10 dəqiqə qaynadın.Sonra nümunələr SDS-PAGE uzun gellərində təhlil edildi və Image Lab Touch proqramı ilə Bio-rad ChemiDoc MP Touch təsvir sistemindən istifadə edərək vizuallaşdırıldı.
Rekombinant miniSOG-6xHis zülalının ifadəsi və təmizlənməsi əvvəllər təsvir edildiyi kimi yerinə yetirildi.Qısaca olaraq, E. coli BL21(DE3) hüceyrələri (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis ilə çevrildi və protein ifadəsi 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168) ilə induksiya edildi.Hüceyrə lizizindən sonra zülallar Ni-NTA agaroz muncuqları (MCE, № 70666) istifadə edərək təmizləndi, PBS-yə qarşı dializ edildi və -80°C-də saxlanıldı.
Antikor əsaslı in vitro etiket yaxınlıq analizi üçün PBS-də 100 μM təmizlənmiş miniSOG, 1 mM zond 3 və 1 μg etiket əleyhinə siçan monoklonal anticismini (TransGen, #HT501-01) ümumi reaksiya həcmi 50 μl olana qədər qarışdırın..Reaksiya qarışığı mavi LED işığı ilə otaq temperaturunda 0, 2, 5, 10 və 20 dəqiqə şüalandı.Qarışıq 0,1 mM biotin-PEG3-azid (Ələddin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA liqand və 1 mM CuSO4 ilə otaq temperaturunda 1 saat yuxarı hərəkət edən çalkalayıcıda inkubasiya edilmişdir.Sürətli reaksiyadan sonra birbaşa qarışığa 4x Laemmli tamponu əlavə edin və 95°C-də 10 dəqiqə qaynadın.Nümunələr SDS-PAGE gellərində təhlil edildi və streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) ilə western blotting ilə təhlil edildi.
C-terminal amidasiyası (LHDALDAK-CONH2) ilə histidin tərkibli sintetik peptid yaxınlıqdakı peptid əsaslı in vitro etiketləməni təhlil etmək üçün istifadə edilmişdir.Bu analizdə 100 μM təmizlənmiş miniSOG, 10 mM prob 3 və 2 μg/ml sintetik peptid 50 μl ümumi reaksiya həcmində PBS-də qarışdırıldı.Reaksiya qarışığı otaq temperaturunda 1 saat mavi LED işığı ilə şüalandı.Bir mikrolitr nümunə LC-MS sistemindən (Waters, MassLynx spektr analiz proqramı ilə SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight kütlə spektrometri) istifadə edərək təhlil edilmişdir.
MiniSOG füzyon genini stabil şəkildə ifadə edən HEK293T hüceyrələri müxtəlif orqanoid lokalizasiyasına (Mito, ER, Nucleus) malik xətlər üçün 10 sm-lik qablara və Parkin-miniSOG və BRD4-miniSOG xətləri üçün 15 sm qablara səpildi.~90% birləşməyə çatdıqdan sonra hüceyrələr bir dəfə HBSS ilə yuyuldu, sonra HBSS-də 37°C-də 1 saat müddətinə prob 3 ilə inkubasiya edildi və otaq temperaturunda 10 Vt mavi LED ilə işıqlandırıldı.Parkinin təmassız etiketlənməsi üçün HBSS-də 10 µM proton karbonil siyanid daşıyıcısı m-xlorofenilhidrazon CCCP (Solarbio, #C6700) 37°C-də 1 saat müddətinə əlavə edildi.Hüceyrə lizisi, klik kimyası, reduksiya və alkilləşmə mərhələləri yuxarıda təsvir olunduğu kimi idi, istisna olmaqla, 2 mq lizat əlavə edildi və klik reaksiyasında fotoparçalanan biotin azid əvəzinə biotin PEG3 azid istifadə edildi.Zənginləşdirildikdən sonra muncuqlar 0,2% SDS olan 5 ml PBS ilə 3 dəfə, 1 M karbamid ehtiva edən 5 ml PBS ilə 3 dəfə və 5 ml PBS ilə 3 dəfə yuyuldu.Bundan sonra, 37°C temperaturda zülalı bir gecədə parçalamaq üçün tərkibində 1 M karbamid olan 300 µl 25 mM ABC-yə 2 µg tripsin əlavə edildi.Reaksiya pH 2-3 olana qədər qarışqa turşusu əlavə edilərək dayandırıldı.Muncuqlarda tripsinizasiya edildikdən sonra peptid məhlulu SOLAµ HRP sütunundan (Thermo, #60209-001) istifadə edilərək duzsuzlaşdırıldı və Speedvac vakuum konsentratorunda quruduldu.Peptidlər 0,1% qarışqa turşusunda yenidən həll edildi və yuxarıda təsvir edilən nano-ESI mənbəyi ilə təchiz olunmuş Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütlə spektrometrindən istifadə etməklə 500 ng peptidlər təhlil edildi.Peptidlər kommersiya RP-HPLC ön sütunlarında (75 μm x 2 sm) (Thermo, № 164946) və analitik RP-HPLC sütunlarında (75 μm x 25 sm) (Thermo, № 164941) ayrıldı, hər ikisi 2 μm ilə dolduruldu.60 dəqiqə ərzində 8% -dən 35% ACN-ə qədər gradient, sonra 300 Nl/dəq axın sürətində xətti olaraq 6 dəqiqə ərzində 98% B-ə yüksəldi.MS spektrləri (350-1500 m/z) 60.000, AGC 4 × 105 və maksimum 50 ms giriş vaxtı ilə toplanmışdır.Seçilmiş ionlar 30% normallaşdırılmış toqquşma enerjisi, 1,6 m/z dördqütblü izolyasiya pəncərəsi və 15000 ayırdetmə qabiliyyəti ilə 3 saniyə ərzində HCD ilə ardıcıl olaraq parçalandı. 5 × 104 tandem kütlə spektrometri AGC hədəfi və maksimum inyeksiya vaxtı 22 ms istifadə edilmişdir.Dinamik istisna 45 saniyəyə təyin edilmişdir. Təyin edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olanlar MS/MS üçün rədd edildi. Təyin edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olanlar MS/MS üçün rədd edildi. MS/MS üçün 1+ və >7+ ilə nənaznachennıe ion və ya ion ilə şarj. Təyin edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olan ionlar MS/MS üçün rədd edildi.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы və ya ионы с зарядами 1+ və >7+ ilə отклоны üçün MS/MS. Müəyyən edilməmiş ionlar və ya yükü 1+ və >7+ olan ionlar MS/MS üçün rədd edildi.
NeutrAvidin muncuqlarının zənginləşdirilməsinə qədər nümunə hazırlama addımları yuxarıda təsvir edilən LC-MS/MS analizində olduğu kimi idi.Yükləmə nəzarəti üçün giriş kimi təxminən 50 μg lizat istifadə edildi və klik reaksiyaları üçün 2 mq lizat istifadə edildi.Zənginləşdirildikdən və neytravidinlə yuyulduqdan sonra bağlanmış zülallar agaroz qatranı muncuqlarına 50 μl Laemmli tamponu əlavə edilərək 95°C-də 5 dəqiqə qaynadılaraq təmizləndi.Nəzarət yükü girişi və muncuqla zənginləşdirilmiş nümunələr SDS-PAGE ilə təhlil edildi və standart Western blot metodları ilə PVDF membranlarına (Millipore, #ISEQ00010) köçürüldü.Membranlar 0,1% tween-20 (TBST) olan TBS-də 5% yağsız süd (Sangon, #A600669) ilə bloklanmış və ardıcıl olaraq birincili və ikincili antikorlarla inkubasiya edilmişdir.İlkin antikorlar TBST-də 5% yağsız süddə 1:1000 nisbətində seyreltilmiş və gecə ərzində 4°C-də inkubasiya edilmişdir.İkincil antikorlar 1:5000 nisbətində istifadə edildi və otaq temperaturunda 1 saat inkubasiya edildi.Membranlar Chemidoc MP görüntüləmə sistemindən istifadə edərək kimilüminesansla görüntülənib.Şəkildəki ləkələrin və gellərin kəsilməmiş bütün skanları xam məlumat kimi təqdim olunur.
Bu tədqiqatda istifadə edilən ilkin antikorlara dovşan anti-SFPQ monoklonal anticismi (CST, № 71992), dovşan anti-FUS monoklonal anticismi (CST, № 67840), dovşan anti-NSUN2 poliklonal antikoru (Proteintech, № 20854-1-) daxildir. AP), dovşan anti-mSin3A poliklonal antikor (Abcam, #ab3479), siçan etiketinə qarşı monoklonal antikor (TransGen, #HT201-02), siçan anti-β-aktin monoklonal antikor (TransGen, #HC201-01), dovşan əleyhinə -CDK2 monoklonal antikor (ABclonal, #A0094), CTBP1-ə dovşan monoklonal antikor (ABclonal, #A11600), DUT-a dovşan poliklonal antikor (ABclonal, #A2901), dovşan poliklonal antikoru DUT (ABclonal, #A2901), dovşan poliklonal antikoru PSMC4 (AB2rab50-), DNAJB1 poliklonal antikor (ABclonal, # A5504).Bu antikorlar TBST-də 5%-li yağsız süddə 1:1000 nisbətində seyreltilmiş halda istifadə edilmişdir.Bu tədqiqatda istifadə edilən ikincil antikorlara 1:5000 seyreltmədə dovşan əleyhinə IgG (TransGen, #HS101-01), siçan əleyhinə IgG (TransGen, #HS201-01) daxildir.
BRD4-ün SFPQ ilə qarşılıqlı əlaqədə olub-olmadığını araşdırmaq üçün HEK293T-ni həddindən artıq ifadə edən sabit HEK293T və BRD4-miniSOG hüceyrələri 10 sm-lik qablara qoyuldu.Hüceyrələr soyuq PBS ilə yuyuldu və 4°C-də 30 dəqiqə ərzində EDTA-sız proteaz inhibitoru ilə 1 ml Pirs IP lizis tamponunda (Thermo Fisher, #87787) parçalandı.Bundan sonra, lizatlar 1,5 ml sentrifuqa borularında toplandı və 4°C-də 10 dəqiqə ərzində 15,871 xg-də sentrifuqa edildi.Supernatant yığıldı və gecə ərzində 4°C-də 5 µg anti-V5 etiketli siçan monoklonal antikoru (CST, #80076) ilə inkubasiya edildi.Təxminən 50 µl protein A/G maqnit muncuqlarını (MCE, #HY-K0202) iki dəfə tərkibində 0,5% Tween-20 olan PBS ilə yuyun.Sonra hüceyrə lizatları aşağıdan yuxarıya doğru fırlanma ilə 4 saat ərzində 4°C-də maqnit muncuqlarla inkubasiya edilmişdir.Sonra muncuqlar dörd dəfə 1 ml PBST tamponu ilə yuyuldu və 95°C-də 5 dəqiqə qaynadıldı.Nümunələr SDS-PAGE gellərində təhlil edildi və standart Western blot metodlarından istifadə edərək PVDF membranlarına köçürüldü.Membranlar TBST-də 5% yağsız süddə bloklanmış və ardıcıl olaraq birincili və ikincili antikorlarla inkubasiya edilmişdir.Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ monoklonal antikor (CST, #71992) TBST-də 5% yağsız süddə 1:1000 nisbətində istifadə edilmiş və gecə ərzində 4°C-də inkubasiya edilmişdir.Anti-dovşan IgG 1:5000 nisbətində istifadə edildi və otaq temperaturunda 1 saat inkubasiya edildi.Membranlar Chemidoc MP görüntüləmə sistemindən istifadə edərək kimilüminesansla görüntülənib.
Solventlə Əlçatan Səth Sahəsi (SASA) təhlili üçün istifadə edilən bütün strukturlar Zülal Məlumat Bankından (PDB)52 və ya AlphaFold Zülal Strukturu Verilənlər Bazasından53 əldə edilmişdir.FreeSASA proqramından istifadə edərək hər bir qalıq üçün mütləq SASA hesablanmışdır.Hər bir struktur üçün orta SASA-nı əldə etmək üçün yalnız etiketlənmiş histidin və onun qonşuları üçün tam və birmənalı SASA məlumatlarından istifadə edilmişdir.Hər bir histidin üçün nisbi həlledici əlçatanlıq (RSA) mütləq SASA dəyərini həlledici üçün mövcud olan empirik maksimum mümkün qalıq səth sahəsinə bölmək yolu ilə hesablanmışdır.Orta RSA 20%-dən aşağı olarsa, bütün histidinlər gizli, əks halda ifşa olunmuş kimi təsnif edildi56.
DDA rejimində əldə edilmiş xam fayllar, ümumi çirkləndiriciləri ehtiva edən müvafiq SwissProt tərəfindən təsdiqlənmiş protein verilənlər bazasında Proteome Discoverer (v2.5) və ya MSfragger (Fragpipe v15.0) istifadə edərək axtarıldı.Peptidlər iki itkin parçalanma yeri olan tam tripsin, sabit modifikasiya kimi karbamoil metilasiyası və dinamik modifikasiya kimi metionin oksidləşməsi tələb edirdi.Prekursor və fraqment çəkisinin toleransları müvafiq olaraq 10 ppm və 0,02 Da (MS2 Orbitrap) olaraq təyin edilmişdir. Çirkləndirici zərbələr çıxarıldı və zülallar süzüldü ki, <1% saxta kəşf dərəcəsi əldə edildi. Çirkləndirici zərbələr çıxarıldı və zülallar süzüldü ki, <1% saxta kəşf dərəcəsi əldə edildi. Popadaniya zaгрязняющих веществ удалены, a belki otfiltrovanı, stoby poluchit profydery obnarujeniya <1%. Çirkləndirici zərbələr çıxarıldı və zülallar süzüldü ki, <1% saxta aşkarlama dərəcəsi əldə edildi.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Popadaniya zaгрязняющих веществ ilə удалены, a belki otfiltrovanı üçün dotijeniya urovnya ложных обнаружений <1%. Çirkləndirici zərbələr çıxarıldı və zülallar süzüldü ki, <1% yanlış müsbət nisbət əldə edildi.Etiketlərdən istifadə etmədən kəmiyyət analizi üçün üç bioloji təkrardan normallaşdırılmış protein tərkibi istifadə edilmişdir.Zülalaltı hüceyrə lokalizasiyası analizi DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 və Alice Ting qrupu tərəfindən tərtib edilmiş və nəşr edilmiş verilənlər bazalarından Gen Ontologiyası (GO) analizindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.Vulkan xəritəsi Perseusdan əldə edilib (v1.6.15.0). Zülal bolluğu qat dəyişiklikləri ikitərəfli t-testindən istifadə edərək statistik əhəmiyyətə görə sınaqdan keçirildi və zülal hitləri bolluğun dəyişməsi >2 (başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə) və p dəyəri <0,05 ilə müəyyən edildi. Zülal bolluğu qat dəyişiklikləri ikitərəfli t-testindən istifadə edərək statistik əhəmiyyətə görə sınaqdan keçirildi və zülal hitləri bolluğun dəyişməsi >2 (başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə) və p dəyəri <0,05 ilə müəyyən edildi. Izmeneniya kratnosti soderjaniya belka byli provereny na statisticheskuyu t-kriteriya, və identifikasiya bölmələri ilə identifikasiyası ilə bağlı t-kriteriyalar haqqında məlumat> 2 (əsli yox idi) və p <0, p <0. Protein məzmununun qat dəyişiklikləri iki quyruqlu t-testindən istifadə edərək statistik əhəmiyyətə görə sınaqdan keçirildi və protein uyğunluqları məzmun dəyişikliyi >2 (başqa cür qeyd edilmədiyi təqdirdə) və ap dəyəri <0,05 ilə müəyyən edildi.使用 双边 T 检验 检验 测试 丰度 丰度 丰度 丰度 丰度 丰度 显着性 显着性 显着性, 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 蛋白质> 2 (除非 另 有说明) 和 p 值 <0.05.使用 双边 T 检验 检验 测试 倍 倍 倍 数 数 数 数 显着性 显着性 显着性 显着性 显着性 显着性 中 中 中 命 命> 2 (另 有 说明) 和 P 值 <0.05. Statistika znachimost kratnıx izmeneniy soderjaniya belka proveryali s istifadə iki t-kriteriya, a совпадения белков определяли üçün изменений содержания >2 (əsli nə uzano inoe) və p-znacheni <0,05. Protein tərkibindəki qat dəyişikliklərinin statistik əhəmiyyəti iki quyruqlu t-testindən istifadə edərək sınaqdan keçirilmiş və məzmun dəyişiklikləri >2 (başqa cür göstərilməyibsə) və p-dəyərləri <0,05 üçün protein uyğunluğu müəyyən edilmişdir.Zülal qarşılıqlı analizi String verilənlər bazası ilə birlikdə GO analizindən istifadə edərək həyata keçirilmişdir.
Bənzər nəticələrlə üç bioloji təkrarlama aparıldı.Statistik təhlil GraphPad Prism (GraphPad proqram təminatı) ilə aparılıb və vulkan planları Perseus (v1.6.15.0) ilə yaradılıb.İki qrupu müqayisə etmək üçün p-dəyərləri iki quyruqlu Tələbənin t-testindən istifadə edərək müəyyən edildi.Yalnız eksperimental qrupda ən azı iki dəfə müəyyən edilmiş təkton zülalları vulkan sahələrinə daxil edildi və nəzarət qrupunda müvafiq çatışmayan dəyərlər normal paylanmadan Perseus ilə əvəz edildi ki, p-dəyəri hesablana bilsin.Səhv çubuqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.Statistik analiz üçün proteomik analizlərdə ən azı iki bioloji təkrarda görünən zülalların bolluğu saxlanılıb.Nümunə ölçüsünü əvvəlcədən müəyyən etmək üçün statistik üsullardan istifadə edilməmişdir.Təcrübələr təsadüfi deyil.Tədqiqatçılar eksperiment zamanı və nəticələrin qiymətləndirilməsi zamanı tapşırıqlara göz yummadılar.
Tədqiqat dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqalə ilə əlaqəli Təbiət Tədqiqat Hesabatının xülasəsinə baxın.
Bu tədqiqatda əldə edilən kütlə spektrometriya məlumatları PXD034811 (PDPL-MS verilənlər toplusu) verilənlər bazası altında iProX57 tərəfdaş anbarı vasitəsilə ProteomeXchange Konsorsiumuna təqdim edilmişdir.Xam məlumatlar xam məlumat faylları şəklində təqdim olunur.Bu məqalə orijinal məlumatları təqdim edir.
Ginqras, AC, Abe, KT & Raught, B. Qonşuluqla tanış olmaq: zülal komplekslərini xarakterizə etmək və orqanelləri xəritələşdirmək üçün yaxınlıqdan asılı biotinilasiyadan istifadə. Ginqras, AC, Abe, KT & Raught, B. Qonşuluqla tanış olmaq: zülal komplekslərini xarakterizə etmək və orqanelləri xəritələşdirmək üçün yaxınlıqdan asılı biotinilasiyadan istifadə.Ginqras, AS, Abe, KT və Raut, B. Ətraf mühitlə tanışlıq: zülal komplekslərini və xəritə orqanellələrini xarakterizə etmək üçün yaxınlıqdan asılı biotinilasiyadan istifadə. Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并。 Ginqras, AC, Abe, KT & Raught, B. Qonşuluğu anlamaq: qonşuluğun bioloji həyatdan asılılığından istifadə edin.Ginqras, AS, Abe, KT və Raut, B. Yaxınlığın başa düşülməsi: protein komplekslərinin səciyyələndirilməsi və yaxınlıqdan asılı biotinilasiyadan istifadə edərək orqanellərin xəritələşdirilməsi.Cari.Mənim fikrim.Kimyəvi.biologiya 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Dexter enerjisini immun hüceyrələrə ötürməklə mikromühitin xəritəsini çəkmək.Elm 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.İki proteom miqyaslı şəbəkələr insan interaktomunun hüceyrəyə xas yenidən qurulmasını aşkar edir.Hüceyrələr 184, 3022–3040.e3028 (2021).