Xəbərlər

Yoluxucu xəstəliklərin aşkarlanması üçün ənənəvi diaqnostika strategiyaları qayğı nöqtəsi testi (POCT) üçün uyğun olmayan tezgah üstü alətlərin istifadəsini tələb edir.İnkişaf etməkdə olan mikrofluidika yüksək dərəcədə miniatürləşdirilmiş, avtomatlaşdırılmış və inteqrasiya olunmuş texnologiyadır ki, bu da sürətli, ucuz, dəqiq yerində diaqnostika üçün ənənəvi metodlara potensial alternativdir.Molekulyar diaqnostika üsulları patogenin aşkarlanması üçün ən effektiv üsul kimi mikrofluidik cihazlarda geniş istifadə olunur.Bu icmal həm akademik, həm də sənaye nöqteyi-nəzərindən yoluxucu xəstəliklərin mikrofluidik əsaslı molekulyar diaqnostikasında son nailiyyətləri ümumiləşdirir.Birincisi, biz nümunənin əvvəlcədən təmizlənməsi, gücləndirilməsi və siqnalın oxunması daxil olmaqla nuklein turşularının tipik bir çip üzərində işlənməsini təsvir edirik.Sonra dörd növ mikrofluidik platformanın xüsusiyyətləri, üstünlükləri və çatışmazlıqları müqayisə edilir.Sonra, nuklein turşularının mütləq miqdarının təyini üçün rəqəmsal analizlərin istifadəsini müzakirə edəcəyik.Həm klassik, həm də yeni kommersiya mikrofluidik əsaslı molekulyar diaqnostika cihazları bazarın mövcud vəziyyətinin sübutu kimi ümumiləşdirilmişdir.Nəhayət, biz yoluxucu xəstəliklərin mikrofluidik diaqnostikasının gələcək istiqamətlərini təklif edirik.
Yoluxucu xəstəliklər bütün dünyada yayılmış patogenlər, o cümlədən bakteriyalar, viruslar və parazitlər tərəfindən törədilir.Digər xəstəliklərdən fərqli olaraq, patogenlər tez yoluxur və peyvənd, hava və su mühiti vasitəsilə insanlar və ev sahibi heyvanlar arasında yayılır [1].Yoluxucu xəstəliklərin qarşısının alınması ictimai sağlamlıq tədbiri kimi vacibdir.Yoluxucu xəstəliklərlə mübarizə üçün üç əsas strategiya: (1) infeksiya mənbəyinə nəzarət;(2) ötürmə yolunun kəsilməsi;(3) həssas populyasiyaların qorunması.Əsas strategiyalar arasında infeksiya mənbəyinə nəzarət rahatlığı və ucuzluğuna görə ən mühüm strategiya hesab olunur.Yoluxmuş şəxslərin sürətli diaqnostikası, təcrid edilməsi və müalicəsi kritikdir, sürətli, həssas və dəqiq diaqnostika strategiyaları tələb edir [2].Yoluxucu xəstəliklərin hazırkı diaqnostikası adətən əlamət və simptomlara əsaslanan klinik müayinəni və hüceyrə kulturası və molekulyar diaqnostika kimi laboratoriya tədqiqatlarını birləşdirir ki, bu da təlim keçmiş kadrlar, əmək tutumlu prosedurlar və bahalı sınaq avadanlığı tələb edir [3, 4].Yoluxucu xəstəliklərin yayılmasının qarşısının alınması, xüsusilə yoluxucu xəstəliklərin tez-tez və şiddətli [5] olduğu resurs məhdud ərazilərdə, həmçinin fövqəladə halların gözlənilməz olduğu səhrada və ya döyüş meydanında müalicənin tez, ucuz və dəqiq lokal diaqnostikasını tələb edir..tibbi xidmət məhduddur [6].Bu kontekstdə mikrofluidika mikroelektromexaniki sistem texnologiyalarını, nanotexnologiyanı və ya material elmini dəqiq maye manipulyasiyası üçün birləşdirən texnologiyadır [7,8,9,10], qayğı nöqtəsinin aşkarlanması (POCT) üçün yeni imkanlar təmin edir.) xəstəxanalardan və laboratoriyalardan kənar yoluxucu agentlər.Ənənəvi vaxt aparan diaqnostika ilə müqayisədə mikrofluidik texnologiya xəstəliyin yayılması zamanı molekulyar diaqnostika üçün nümunə və xərclərə qənaət təklif edir.2019-cu il koronavirus xəstəliyinin (COVID-19) qlobal yayılmasına kəskin kəskin respirator sindrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) səbəb olduğu üçün pandemiyanın vaxtında qarşısının alınması və nəzarəti üçün mikrofluidlərin əhəmiyyəti bir daha vurğulanır [11, 12] , 13].Ənənəvi diaqnostikadan fərqli olaraq, mikrofluidik POCT nümunə götürmə nöqtəsi yaxınlığında test etmək üçün stolüstü analizatorlardan tutmuş kiçik yan axın test zolaqlarına qədər kiçik portativ cihazlardan istifadə edir [14].Bu testlər sadələşdirilmiş və ya heç bir nümunə hazırlama, sürətli siqnal gücləndirmə və həssas siqnal oxunuşları ilə nəticələnir ki, bu da qısa müddətə və dəqiqələr ərzində dəqiq nəticələrə gətirib çıxarır.Mikrofluidik əsaslı səhiyyə alətlərinin mövcudluğu və kütləvi istehsalı onların xəstəxanadan kənarda, xəstənin yanında və hətta evdə sərfəli və birbaşa diaqnostika tətbiqlərini genişləndirdi.
Yoluxucu xəstəliklərin diaqnostikası üçün mövcud strategiyalar arasında molekulyar diaqnostika ən həssaslardan biridir [15, 16].Bundan əlavə, molekulyar diaqnostika tez-tez COVID-19-un davamlı aşkarlanması üçün qızıl standart kimi istifadə olunur, immun reaksiya başlamazdan əvvəl RNT və ya DNT-nin virusa xüsusi bölgələrini birbaşa aşkar etməyə imkan verir [17, 18].Cari icmalda biz infeksion xəstəliklər üçün mikrofluidikaya əsaslanan molekulyar diaqnostika proseslərində akademik perspektivdən gələcək sənaye perspektivlərinə qədər ən son nailiyyətləri təqdim edirik (Şəkil 1).Biz nuklein turşusunun aşkarlanmasında üç əsas addımdan başlayacağıq: çipdə nümunənin əvvəlcədən təmizlənməsi, nuklein turşusunun gücləndirilməsi və siqnalın oxunması.Daha sonra biz unikal xüsusiyyətləri (güclü və zəif tərəfləri) göstərən müxtəlif növ mikrofluid platformalarını strukturu və funksiyası ilə müqayisə etdik.Rəqəmsal nuklein turşusunun aşkarlanması daha sonra müzakirə edilir və yoluxucu patogen molekulların mütləq miqdarının təyini üçün üçüncü nəsil texnologiya nümunəsi kimi verilir.Bundan əlavə, molekulyar diaqnostika üçün mikrofluidik POCT bazarının mövcud vəziyyətini nümayiş etdirmək üçün bir neçə tipik və ən son kommersiya POCT cihazları təqdim ediləcək.Gələcək tətbiqlər üçün baxışımızı da müzakirə edəcəyik və izah edəcəyik.
Nuklein turşusunun aşkarlanması üçün mikrofluidik çiplərin modullarını funksiyalarına görə üç kateqoriyaya (nümunə götürmə, tanıma və siqnal vermə) bölmək olar [19].Bu modullar arasında seçmə modulu əsasən nümunə lizisini və nuklein turşusunun çıxarılmasını həyata keçirir.Sensor modulu əsasən nuklein turşusu siqnallarının çevrilməsinə və gücləndirilməsinə nəzarət edir.Siqnal modulu sensor modulu tərəfindən çevrilmiş və işlənmiş siqnalı aşkar edir.Çipdə nuklein turşularının aşkarlanması prosesinə əsaslanaraq, “giriş və çıxış” funksiyasını həyata keçirə bilən müxtəlif çipləri ümumiləşdirəcəyik.
Nuklein turşusunun aşkarlanmasında ilk addım nuklein turşusunun çıxarılmasıdır, yəni hədəf nuklein turşusunun orijinal nümunədən təcrid olunmasıdır.Nuklein turşusunun çıxarılması nuklein turşularını digər molekulyar çirkləndiricilərdən təmizləmək, nuklein turşusu molekullarının ilkin strukturunun bütövlüyünü təmin etmək və nəticələri optimallaşdırmaq üçün həyata keçirilir.Nuklein turşusunun çıxarılması keyfiyyəti və səmərəliliyi tədqiqat və diaqnostika nəticələrinə böyük təsir göstərən lazımi nümunə lizisi və nuklein turşusunun tutulmasını tələb edir.Ekstraksiya zamanı hər hansı incə yan təsirlər əlavə aşkarlanmağı məhdudlaşdıra bilər.Məsələn, polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) və loop izotermik gücləndirmə (LAMP) üsulları nuklein turşusu izolyasiya reagentlərində etanol və izopropanol kimi bəzi qalıq üzvi həlledicilər tərəfindən inhibə edilir [20].Maye-maye ekstraksiyası və bərk fazalı ekstraksiya nuklein turşularının təcrid edilməsi üçün ən məşhur üsullardır [21], lakin çipdə maye-maye ekstraksiya çox məhduddur, çünki maye-maye ekstraksiyasında istifadə olunan reagentlər əksər mikro-maye çiplərinin korroziyasına səbəb olur. .Burada biz mikroarray əsaslı bərk fazanın çıxarılması üsullarını vurğulayır və onların üstünlüklərini və mənfi cəhətlərini müqayisə edirik.
Silikon biouyğunluğu, sabitliyi və modifikasiya asanlığına görə nuklein turşuları ilə uyğun gələn substrat materialıdır [22].Vacib odur ki, silisium dioksid və ya digər materiallarla dəyişdirildikdə, bu kompozit yüksək pH, aşağı duz məhlulları ilə yuyularkən aşağı pH, yüksək duz şəraitində mənfi yüklü nuklein turşularını adsorbsiya etmək xüsusiyyətlərini nümayiş etdirir.Bu fenomenə əsasən, nuklein turşusunu təmizləmək mümkündür.
Silisium muncuqları, tozlar, mikrofiber filtrlər və silisium membranları kimi mikrofluidlərdə nuklein turşusunun çıxarılması üçün silisium əsaslı materialların müxtəlif formaları istifadə edilmişdir [23, 24, 25, 26].Materialın xüsusiyyətlərindən asılı olaraq, silikon əsaslı materiallar mikrosxemlərdə müxtəlif yollarla istifadə edilə bilər.Məsələn, silisium qranulları, tozlar və kommersiya nanofiltrləri sadəcə olaraq mikrofluidik çiplərin məsamələrinə və ya mikrokanallarına yerləşdirilə və nümunələrdən nuklein turşularının çıxarılmasına kömək edə bilər [27, 28, 29].Səthi modifikasiya edilmiş silisium membranları aşağı qiymətə DNT-ni patogenlərdən sürətlə təmizləmək üçün də istifadə edilə bilər.Məsələn, Wang et al.[30] Xitozan oliqosakaridləri ilə örtülmüş silisium membranları ilə vezikül vasitəçiliyi ilə zəncir mübadiləsi ilə denaturasiya gücləndirici reaksiyaları birləşdirərək, 102-108 koloniya əmələ gətirən vahidləri müvəffəqiyyətlə aşkar edən çox yönlü portativ sistem təqdim edildi.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., və virusun varlığı asanlıqla görünürdü.Powell et al.[31] Silikon əsaslı mikroarraylar daha sonra hepatit C virusunu (HCV), insanın immun çatışmazlığı virusunu (HİV), Zika virusunu və insan papillomavirusunu aşkar etmək üçün istifadə edildi və RNT viruslarını tutmaq üçün 1,3 μl əyilməli mikroreaktor hazırlanmışdır.və yerində gücləndirmə həyata keçirin.Bu üsullara əlavə olaraq, səthi dəyişdirilmiş silisium mikrokolonları da nuklein turşusunun çıxarılmasında əsas rol oynayır, çünki modifikasiya edən materialın həndəsəsi və xassələri ekstraksiya səmərəliliyini xeyli artırır.Chen və başqaları.[32] aminlə örtülmüş silikon mikro sütunlara əsaslanan aşağı konsentrasiyalı RNT-nin təcrid edilməsi üçün mikrofluidik platforma təklif etmişdir.Bu mikrofluidik cihaz yüksək səth sahəsinə həcm nisbəti dizaynı vasitəsilə daha yüksək hasilat səmərəliliyinə nail olmaq üçün silikon substratda 0,25 sm2 mikropillar massivini birləşdirir.Bu dizaynın üstünlüyü ondan ibarətdir ki, mikrofluidik cihaz 95%-ə qədər nuklein turşusunun çıxarılması səmərəliliyinə nail ola bilir.Bu silikon əsaslı strategiyalar aşağı qiymətə sürətlə təcrid olunan nuklein turşularının dəyərini nümayiş etdirir.Mikrofluidik çiplərlə birlikdə silisium əsaslı ekstraksiya strategiyaları yalnız nuklein turşusunun aşkarlanmasının səmərəliliyini artırmaqla yanaşı, analitik cihazların miniatürləşdirilməsini və inteqrasiyasını asanlaşdıra bilər [20].
Maqnit ayırma üsulları xarici maqnit sahəsinin mövcudluğunda nuklein turşularını təcrid etmək üçün maqnit hissəciklərindən istifadə edir.Ümumi istifadə edilən maqnit hissəciklərinə silisium, amin və karboksil ilə örtülmüş Fe3O4 və ya γ-Fe2O3 maqnit hissəcikləri daxildir [33,34,35,36].Silikon əsaslı SPE üsulları ilə müqayisədə maqnit hissəciklərinin fərqləndirici xüsusiyyəti xarici maqnitlərlə manipulyasiya və nəzarətin asanlığıdır.
Yüksək duz və aşağı pH şəraitində nuklein turşuları və silisium oksidi arasındakı elektrostatik qarşılıqlı təsirdən istifadə edərək, nuklein turşuları silisiumla örtülmüş maqnit hissəciklərinin səthində adsorbsiya olunur, aşağı duz və yüksək pH şəraitində isə molekullar yuyula bilər. yenidən..Silisiumla örtülmüş maqnit muncuqları maqnitlə idarə olunan hərəkətdən istifadə edərək böyük həcmli nümunələrdən (400 μL) DNT çıxarmağa imkan verir [37].Nümayiş olaraq, Rodriguez-Mateos et al.[38] maqnit muncuqlarının müxtəlif kameralara köçürülməsini idarə etmək üçün tənzimlənən maqnitlərdən istifadə etmişdir.Silisiumla örtülmüş maqnit hissəciklərinə əsaslanaraq, LAMP tərs transkripsiyanın aşkarlanması (RT-LAMP) üçün çirkab su nümunələrindən 470 nüsxə/ml SARS-CoV-2 genomik RNT çıxarıla bilər və cavab 1 saat ərzində oxuna bilər.çılpaq gözlə (şək. 2a).
Maqnit və məsaməli materiallara əsaslanan qurğular.SARS-CoV-2 RNT aşkarlanması üçün IFAST RT-LAMP mikro maye cihazının konseptual diaqramı ([38]-dən uyğunlaşdırılmışdır).b Bukkal tampon nuklein turşusunun dSPE üçün mərkəzdənqaçma mikro cihazı ([39]-dan uyğunlaşdırılmışdır).c FTA® kartından istifadə etməklə quraşdırılmış öz-özünə işləyən nümunə konsentratoru ([50]-dən uyğunlaşdırılmışdır).d Xitosanla dəyişdirilmiş Fusion 5 filtr kağızı ([51]-dən uyğunlaşdırılmışdır).SARS-CoV-2 şiddətli kəskin tənəffüs sindromu coronavirus 2, RT-LAMP əks transkripsiya dövrəsi vasitəçiliyi ilə izotermik gücləndirmə, FTA tapıcı texnologiya tərəfdaşları, NA nuklein turşusu
Müsbət yüklü maqnit hissəcikləri nuklein turşusunun fosfat əsasını birləşdirmək üçün idealdır.Müəyyən bir duz konsentrasiyasında nuklein turşularının mənfi yüklü fosfat qrupları maqnit kompozit hissəciklərin səthində müsbət yüklənə bilər.Buna görə də, nuklein turşularının çıxarılması üçün kobud səthə və yüksək sıxlığa malik amin qruplarına malik maqnit nanohissəciklər hazırlanmışdır.Maqnit ayırma və bloklamadan sonra maqnit nanohissəcikləri və DNT kompleksləri birbaşa PCR-də istifadə oluna bilər ki, bu da mürəkkəb və vaxt aparan təmizləmə və elüsyon əməliyyatlarına ehtiyacı aradan qaldırır [35].Mənfi karboksil qrupları ilə örtülmüş maqnit nanohissəcikləri yüksək konsentrasiyalı polietilen qlikol və natrium xlorid məhlullarında səthlərdə adsorbsiya edilmiş nuklein turşularını ayırmaq üçün də istifadə edilmişdir [36].Bu səthi dəyişdirilmiş maqnit muncuqları ilə DNT çıxarılması sonrakı gücləndirmə ilə uyğun gəlir.Dignan et al.[39] nuklein turşusunun ilkin təmizlənməsi üçün avtomatlaşdırılmış və portativ mərkəzdənqaçma mikro-maye platformasını təsvir edərək, qeyri-texniki işçilərə saytda istifadə etməyə imkan verir.Bundan əlavə, təcrid olunmuş DNT-nin LAMP ilə uyğunluğu, nuklein turşusunun qayğı nöqtəsi analizi üçün yaxşı uyğunlaşdırılmış üsul, əlavə olaraq minimal avadanlıq tələblərini və kolorimetrik analizlər üçün uyğunluğu nümayiş etdirir (Şəkil 2b).
Maqnit muncuq üsulları avtomatlaşdırılmış ekstraksiya imkanını təklif edir, bəziləri kommersiya avtomatlaşdırılmış nuklein turşusu ekstraktorlarında mövcuddur [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ABŞ), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekin, Çin) və Biomek®;Bekman (Mayami, ABŞ).), Florida, ABŞ)].Maqnit muncuqları mikrofluidlərlə birləşdirməyin üstünlükləri nuklein turşularının səmərəli avtomatlaşdırılmış çıxarılması üçün istifadə edilə bilər ki, bu da molekulyar diaqnostikanın inkişafını potensial olaraq inkişaf etdirə bilər;lakin, maqnit muncuqların mikrofluidika ilə birləşməsi hələ də maqnit muncuqların dəqiq manipulyasiyası üçün mürəkkəb idarəetmə sistemlərinə çox etibar edir, bu da kommersiya məhsullarının populyarlığını böyük və bahalı olduğunu izah edir, bu da POCT-də maqnit muncuqların sonrakı tətbiqini məhdudlaşdırır.
Nuklein turşusunun aşkarlanması üçün dəyişdirilmiş nitroselüloz filtrləri, Finders Technology Associates (FTA) kartları, polietersulfon əsaslı filtr kağızları və qlikanla örtülmüş materiallar kimi bir neçə məsaməli materiallar da istifadə edilmişdir [40, 41, 42, 43, 44].Fibröz kağız kimi məsaməli lifli materiallar ilk dəfə uzun zəncirli DNT molekullarını liflərlə fiziki olaraq dolaşdırmaqla DNT-ni təcrid etmək üçün istifadə edilmişdir.Kiçik məsamələr DNT molekullarının güclü fiziki məhdudiyyətinə gətirib çıxarır ki, bu da DNT ekstraksiyasına müsbət təsir göstərir.Fibröz kağızın müxtəlif məsamə ölçülərinə görə ekstraksiya effektivliyi DNT gücləndirilməsi ehtiyaclarını ödəyə bilmir [45, 46].FTA kartı məhkəmə tibb sahəsində istifadə olunan və molekulyar diaqnostikanın digər sahələrində geniş istifadə olunan kommersiya filtr kağızıdır.Nümunədəki hüceyrə membranlarını parçalamaq üçün müxtəlif kimyəvi maddələrlə hopdurulmuş selüloz filtr kağızından istifadə etməklə sərbəst buraxılan DNT 2 ilə qədər deqradasiyadan qorunur.Bu yaxınlarda, SARS-CoV-2, leyşmanioz və malyariya daxil olmaqla müxtəlif patogenlərin molekulyar aşkarlanması üçün hopdurulmuş selüloz kağızı hazırlanmışdır [47,48,49].İzolyasiya olunmuş plazmada HİV birbaşa parçalanır və viral nuklein turşusu konsentratorda quraşdırılmış FTA® axın membranında zənginləşir ki, bu da nuklein turşusunun səmərəli istehsalına imkan verir [50] (Şəkil 2c).FTA kartlarından istifadə edərək nuklein turşusunun aşkarlanması ilə bağlı əsas problem, guanidin və izopropanol kimi kimyəvi maddələrin sonrakı gücləndirmə reaksiyalarını maneə törətməsidir.Bu problemi həll etmək üçün biz Fusion 5 xitosanla modifikasiya olunmuş filtr kağızı hazırladıq ki, bu da həm DNT molekullarının, həm də lifli filtr kağızının fiziki bir-birinə qarışmasının üstünlüklərini, həm də yüksək effektiv nuklein turşusu ekstraksiyasına nail olmaq üçün xitosanla dəyişdirilmiş birləşmələrdə DNT-nin elektrostatik adsorbsiyasını birləşdirdi. ..filtr lifləri [51] (şək. 2d).Eynilə, Zhu et al.[52] Zika virus RNT-nin sürətli izolyasiyası və aşkarlanması üçün in situ kapilyar mikrofluidik sistemə əsaslanan xitosanla modifikasiya olunmuş PCR metodunu nümayiş etdirmişdir.Nuklein turşuları, xitosanın yandırma/söndürmə xüsusiyyətinə əsasən, müvafiq olaraq, qarışıq lizat/PZR mühitində adsorbsiya/desorbsiya edilə bilər.On və off”, pH-a cavab verir.
Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, bu strategiyalar müxtəlif bərk fazalı materialların üstünlüklərini birləşdirir və mikrofluidiklərdə nuklein turşusunun çıxarılmasının səmərəliliyini artırır.Praktik tətbiqlərdə bu materialların böyük miqdarda istifadəsi qənaətsizdir və bu materiallarla düzgün səth müalicəsi və ya ümumi materialların səthinin dəyişdirilməsi də onların funksiyasını qoruya bilər.Buna görə də hesab edilir ki, bu strategiyaların pilot tədqiqatdan sonra həyata keçirilməsi xərcləri azalda bilər.
Mikrofluidik platformalarda nuklein turşusunun sınağı çox vaxt kiçik nümunə həcmlərindən (<100 µl) istifadə edir, buna görə də aşağı axının aşkarlanması (optik, elektrik və maqnit) üçün əlverişli olan siqnala çevrilmək üçün hədəf nuklein turşularının xüsusi zondlarla gücləndirilməsi tələb olunur [53, 54]. Mikrofluidik platformalarda nuklein turşusunun sınağı çox vaxt kiçik nümunə həcmlərindən (<100 µl) istifadə edir, buna görə də aşağı axının aşkarlanması (optik, elektrik və maqnit) üçün əlverişli olan siqnala çevrilmək üçün hədəf nuklein turşularının xüsusi zondlarla gücləndirilməsi tələb olunur [53, 54]. (< 100 mkl) sınaqdan keçirin, mikrojidkostnıx platforması ilə sınaqdan keçirin. Mikrofluidik platformalarda nuklein turşularını sınaqdan keçirərkən tez-tez kiçik nümunə həcmlərindən (<100 µL) istifadə olunur, buna görə də onu sonrakı aşkarlama (optik, elektrik və maqnit) üçün əlverişli siqnala çevirmək üçün hədəf nuklein turşularının xüsusi zondlarla gücləndirilməsi tələb olunur. [53, 54].微流控 平台 上 的 的 核酸 检测 通常 上 使用 通常 通常 通常 使用 通常 通常 通常 使用 使用 使用 使用 使用 使用 特定 探针 扩增 目标 目标 核酸, 以 转换 为 便于 下游 下游 检测 (光学, 电学 和 磁学) 的的 [53, 54 ]。微流控 平台 上 上 的 核酸 检测 使用 使用本量 ((<100 μl), 因此 需要 特定 探针 探针 扩增 目标, 以 转换 为 下游 下游 (光学, 电学 磁学) 的 信号 [53, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54 ]。 Mikrojidkostnıx platformalar üçün istifadə olunan nükleinovıx kislot (<100 mkl), bu, 5-də elektrik enerjisi ilə təchiz olunmuş nükleinovıx kislotun amplifikasii celevыh nükleinovıx kislotun (5-də 5-ci yerdə) xüsusi siqnal zonasını istifadə etmək imkanı verir. Mikrofluidik platformalarda nuklein turşularının aşkarlanması adətən kiçik nümunə həcmlərindən (<100 μl) istifadə edir ki, bu da hədəf nuklein turşularının sonrakı aşkarlanması (optik, elektrik və maqnit) üçün siqnallara çevrilməsi üçün xüsusi zondlarla gücləndirilməsini tələb edir [53, 54]] .Mikrofluidiklərdə nuklein turşusunun gücləndirilməsi də reaksiyaları sürətləndirə, aşkarlama limitlərini optimallaşdıra, nümunə tələblərini azalda və aşkarlama dəqiqliyini yaxşılaşdıra bilər [55, 56].Son illərdə sürətli və dəqiq aşkarlamanın həyata keçirilməsi ilə mikrofluidiklərdə müxtəlif nuklein turşusu gücləndirmə üsulları, o cümlədən PCR və bəzi izotermik gücləndirmə reaksiyaları tətbiq edilmişdir.Bu bölmə mikrofluidik sistemlərə əsaslanan nuklein turşusunun aşkarlanması üsullarını ümumiləşdirəcək.
PCR bir orqanizmin DNT replikasiyası prosesinin simulyasiyasıdır, nəzəriyyəsi başqa yerdə ətraflı təsvir edilmişdir və burada müzakirə edilməyəcəkdir.PCR çox az miqdarda hədəf DNT/RNT-ni eksponensial sürətlə gücləndirə bilər, bu da PCR-ni nuklein turşularının sürətli aşkarlanması üçün güclü vasitəyə çevirir.Son onilliklərdə qayğı nöqtəsi diaqnostikasının ehtiyaclarını ödəmək üçün PCR termal velosiped sistemləri ilə təchiz edilmiş bir çox portativ mikrofluidik cihazlar hazırlanmışdır [57, 58].Fərqli temperatur tənzimləmə üsullarına görə çip üzərində PZR dörd növə bölünə bilər (şərti, davamlı axın, məkanda keçidli və konvektiv PZR) [59].Məsələn, Gee et al.[60] boğaz tampon nümunələrində SARS-CoV-2, qrip A və B viruslarının multipleks aşkarlanması üçün öz mikrofluidik platformasında birbaşa tərs transkripsiyalı kəmiyyət PCR (RT-qPCR) metodu işləyib hazırlamışdır (Şəkil 3a).Park et al.[61] nazik film PCR, elektrodlar və barmaqla idarə olunan polidimetilsiloksan əsaslı mikrofluidik modulu birləşdirərək sadə patogen analiz çipi qurdu.Bununla belə, hər iki əsər adi PCR-nin ümumi çatışmazlıqlarını təcəssüm etdirir.PCR istilik dövriyyəsini tələb edir ki, bu da cihazın daha da miniatürləşdirilməsini və sınaq müddətini azaldır.
Davamlı axın əsaslı mikrofluidik və kosmik keçidli PCR-nin inkişafı bu problemi həll etmək üçün çox vacibdir.Uzun serpantin kanalı və ya qısa düz kanaldan istifadə edərək davamlı axın PCR reagentləri çipdənkənar nasosla üç əvvəlcədən qızdırma zonasında aktiv şəkildə dövriyyə edərək sürətli gücləndirmə təmin edə bilər.Bu əməliyyat müxtəlif reaksiya temperaturları arasında keçid mərhələsindən uğurla qaçır və beləliklə, sınaq müddətini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır [62] (Şəkil 3b).Jung et al tərəfindən edilən başqa bir araşdırmada.[63] ultrafast və multipleks əks transkripsiya PCR üçün sabit və axın PCR xüsusiyyətlərini birləşdirən yeni fırlanan PCR genetik analizatoru təklif etdi (Şəkil 3c).Nuklein turşusunun gücləndirilməsi üçün PCR mikroçipi müxtəlif temperaturda üç isitmə bloku vasitəsilə fırlanacaq: 1. Denatürasiya bloku 94°C, 2. 58°C-də yumşalma bloku, 3. 72°C-də genişlənmə bloku.
Mikrofluidikada PCR-nin tətbiqi.Mikrofluidik platformada dirRT-qPCR-nin sxematik təsviri ([60]-dan uyğunlaşdırılmışdır).b Serpantin kanalına əsaslanan davamlı axın PCR mikroarrayının sxematik təsviri ([62]-dən uyğunlaşdırılmışdır).c Mikroçipdən, üç qızdırıcı blokdan və pilləli mühərrikdən ibarət fırlanan PCR genetik analizatorunun sxematik təsviri ([63]-dən uyğunlaşdırılmışdır).d Mərkəzdənqaçma və quraşdırma ilə termokonveksiya PZR diaqramı ([64]-dən uyğunlaşdırılmışdır).DirRT-qPCR, birbaşa kəmiyyət tərs transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiya
Kapilyarlardan və döngələrdən və ya hətta nazik lövhələrdən istifadə edərək, konveksiya PCR xarici nasosa ehtiyac olmadan təbii sərbəst termal konveksiya ilə nuklein turşularını sürətlə gücləndirə bilər.Məsələn, bir PCR döngə mikrokanalında sentrifuqalama ilə termal dövriyyədən istifadə edən hazır fırlanan isitmə mərhələsində siklik olefin polimer mikrofluid platforması hazırlanmışdır [64] (Şəkil 3d).Reaksiya məhlulu həlqəvi bir quruluşa malik mikrokanalda davamlı olaraq yüksək və aşağı temperatur mübadiləsi aparan termal konveksiya ilə idarə olunur.Bütün gücləndirmə prosesi 70,5 pg/kanal aşkarlama limiti ilə 10 dəqiqə ərzində tamamlana bilər.
Gözlənildiyi kimi, sürətli PCR tam inteqrasiya olunmuş nümunə-cavab molekulyar diaqnostika və multipleks analiz sistemləri üçün güclü vasitədir.Sürətli PCR, SARS-CoV-2-nin aşkarlanması üçün tələb olunan vaxtı əhəmiyyətli dərəcədə azaldır ki, bu da COVID-19 pandemiyasına effektiv nəzarəti təmin edir.
PCR üçün POCT üçün uyğun olmayan mürəkkəb termal siklator tələb olunur.Bu yaxınlarda izotermik gücləndirmə üsulları, o cümlədən LAMP, rekombinaz polimeraz gücləndirmə (RPA) və nuklein turşusu ardıcıllığına əsaslanan gücləndirmə [65,66,67,68] daxil olmaqla, lakin bununla məhdudlaşmayaraq, mikrofluidiklərə tətbiq edilmişdir.Bu üsullarla nuklein turşuları sabit temperaturda gücləndirilir və molekulyar diaqnostika üçün aşağı qiymətli, yüksək həssas portativ POCT cihazlarının yaradılmasını asanlaşdırır.
Yüksək məhsuldarlıqlı mikrofluidikaya əsaslanan LAMP analizləri yoluxucu xəstəliklərin çoxsaylı aşkarlanmasına imkan verir [42, 69, 70, 71].Mərkəzdənqaçma mikrofluid sistemi ilə birlikdə LAMP nuklein turşusunun aşkarlanmasının avtomatlaşdırılmasını daha da asanlaşdıra bilər [69, 72, 73, 74, 75].Spin və reaksiya verən SlipChip LAMP [76] istifadə edərək çoxsaylı paralel bakteriyaların vizual aşkarlanması üçün hazırlanmışdır (Şəkil 4a).Təhlildə optimallaşdırılmış LAMP istifadə edildikdə, flüoresan siqnalın səs-küy nisbəti təxminən 5 dəfə idi və aşkarlama həddi genomik DNT-nin 7,2 nüsxəsi/μl-ə çatdı. Üstəlik, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis və Vibrio parahaemolyticus daxil olmaqla, beş ümumi həzm bakteriyası patogeninin mövcudluğu <60 dəqiqə ərzində metod əsasında vizuallaşdırıldı. Üstəlik, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis və Vibrio parahaemolyticus daxil olmaqla, beş ümumi həzm bakteriyası patogeninin mövcudluğu <60 dəqiqə ərzində metod əsasında vizuallaşdırıldı.Üstəlik, həzm sisteminin beş ümumi bakterial patogeninin, o cümlədən Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis və Vibrio parahaemolyticusun mövcudluğu bu metoddan istifadə etməklə 60 dəqiqədən az müddətdə görüntülənib.此外, 基于 该 方法 方法 在 <60 分钟 分钟 内 可 视化 了 五 五 五 五 五 细菌病 细菌病 细菌病 原体 细菌病 细菌病 细菌病, 包括 芽孢杆菌, 大 肠杆菌, 肠 肠杆菌 氏 氏 菌, 河流 弧菌 氏 氏, 河流 弧菌 和 副溶血性 副溶血性.此外, 基于 该 方法 方法 在 在 在 分钟 内 内 视化 了 五 种 种 种 种 种 种, 包括, 大, 大, 肠 肠杆菌, 肠 氏, 弧菌 氏 菌, 弧菌 和 副溶血 性 ... 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPBundan əlavə, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius və Vibrio parahaemolyticus daxil olmaqla, beş ümumi bakterial mədə-bağırsaq patogeninin mövcudluğu bu metoddan istifadə etməklə 60 dəqiqədən az müddətdə görüntülənib.
Mikrofluidikada LAMP-ın üstünlükləri digərləri arasında sürətli reaksiya və miniatürləşdirilmiş aşkarlama daxildir.Bununla belə, reaksiya temperaturu (təxminən 70°C) səbəbindən LAMP zamanı qaçılmaz olaraq aerozollar əmələ gəlir və nəticədə yüksək yanlış müsbət sürət yaranır.Təhlil spesifikliyi, primer dizaynı və temperatur nəzarəti də LAMP üçün optimallaşdırılmalıdır.Bundan əlavə, bir çipdə çoxsaylı hədəf aşkarlamasını həyata keçirən çip dizaynları böyük dəyərə malikdir və işlənib hazırlanmalıdır.Bundan əlavə, LAMP bir çipə inteqrasiya olunmuş çoxməqsədli aşkarlama üçün uyğundur, bu, böyük əhəmiyyət kəsb edir, lakin hələ də inkişaf üçün çox yer var.
Nisbətən aşağı reaksiya temperaturu (~37 °C) nisbətən az buxarlanma problemi ilə nəticələndiyi üçün LAMP-ın yüksək yanlış müsbət dərəcəsi RPA ilə qismən azaldıla bilər [77].RPA sistemində iki əks primer rekombinaza bağlanaraq DNT sintezini başlatır və amplifikasiya 10 dəqiqə ərzində tamamlana bilər [78,79,80,81].Buna görə də, bütün RPA prosesi PCR və ya LAMP-dən daha sürətlidir.Son illərdə mikrofluidik texnologiyanın RPA-nın sürətini və dəqiqliyini daha da yaxşılaşdırdığı göstərilmişdir [82,83,84].Məsələn, Liu et al.[85] tərs transkripsiya RPA (RT-RPA) və universal yanal axın test zolağı aşkarlama sistemini birləşdirərək SARS-CoV-2-nin sürətli və həssas aşkarlanması üçün mikrofluidik inteqrasiya olunmuş yanal axın polimeraza rekombinaz gücləndirmə analizi hazırladı.vahid mikrofluidik sistemə çevrilir.Şəkil 4b).Aşkarlama limiti 1 nüsxə/µl və ya 30 nüsxə/nümunədir və aşkarlama təxminən 30 dəqiqə ərzində tamamlana bilər.Kong və başqaları.geyilə bilən mikrofluidik cihaz hazırlayıblar.[86] RPA istifadə edərək HİV-1 DNT-ni sürətli və birbaşa aşkar etmək üçün bədən istiliyindən və mobil telefona əsaslanan flüoresan aşkarlama sistemindən istifadə etmişdir (Şəkil 4c).Geyilə bilən RPA analizi 24 dəqiqə ərzində hədəf ardıcıllığın 100 nüsxəsini/mL-ni aşkar edərək, resurs məhdud şəraitdə HİV-1-ə yoluxmuş körpələrin sürətli diaqnostikası üçün böyük potensial nümayiş etdirir.
Baxım nöqtəsi testində (POCT) izotermik gücləndirmə.Spin və reaksiya SlipChip-in inkişafı və istehsalı.Plazma qaynağından sonra üst və alt çiplər son çipi yaratmaq üçün qoz-fındıq dəsti ilə yığılmışdır ([76]-dan uyğunlaşdırılmışdır).b COVID-19 aşkarlanması üçün MI-IF-RPA sisteminin sxemi ([85]-dən uyğunlaşdırılmışdır).c HİV-1 DNT-nin sürətli aşkarlanması üçün geyilə bilən RPA testinin sxemi ([86]-dan uyğunlaşdırılmışdır).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, insan immunçatışmazlığı virusu HİV, RPA rekombinaz polimeraza gücləndirilməsi, LED işıq yayan diode-mikrokombinaz rekombinazası Gücləndirmə
Mikrofluidik əsaslı RPA sürətlə inkişaf edir, lakin çip istehsalı və reaksiya istehlakının dəyəri çox yüksəkdir və bu texnologiyanın mövcudluğunu artırmaq üçün azaldılmalıdır.Bundan əlavə, RPA-nın yüksək həssaslığı qeyri-spesifik məhsulların gücləndirilməsinə təsir göstərə bilər, xüsusən də çirklənmə olduqda.Bu məhdudiyyətlər RPA-nın mikrofluidik sistemlərdə tətbiqinə təsir göstərə bilər və əlavə optimallaşdırmaya layiqdir.POCT-də RPA əsaslı mikrofluidik strategiyaların mümkünlüyünü yaxşılaşdırmaq üçün müxtəlif hədəflər üçün yaxşı dizayn edilmiş primerlər və zondlar da lazımdır.
Cas13 və Cas12a nuklein turşularını təsadüfi parçalamaq qabiliyyətinə malikdir və beləliklə, aşkarlama və diaqnostika alətləri kimi inkişaf etdirilə bilər.Cas13 və Cas12a müvafiq olaraq hədəf DNT və ya RNT-yə bağlandıqdan sonra aktivləşir.Aktivləşdirildikdən sonra zülal yaxınlıqdakı digər nuklein turşularını parçalamağa başlayır, bundan sonra patogenə xas nuklein turşularını hədəf alan bələdçi RNT-lər söndürülmüş flüoresan zondları parçalaya və flüoresans buraxa bilər.Bu nəzəriyyəyə əsaslanaraq, Kellner et al.[87] Cas13 əsaslı metod [Xüsusi Yüksək Həssaslıqlı Enzimatik Reportyorun KİLİDİ ​​AÇMA (SHERLOCK)] inkişaf etdirdi və Broughton et al.[88] Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNT endonuclease (DTECR)] əsasında başqa bir yanaşma hazırladı.
Son illərdə CRISPR əsasında nuklein turşularının aşkarlanması üçün müxtəlif üsullar yaranmışdır [89, 90].Ənənəvi CRISPR əsaslı üsullar, nuklein turşusunun çıxarılması, gücləndirilməsi və CRISPR aşkarlanması da daxil olmaqla, çoxsaylı prosedurlara görə çox vaxt vaxt aparan və əmək tələb edir.Mayelərin havaya məruz qalması yanlış müsbət nəticələr şansını artıra bilər.Yuxarıdakıları nəzərə alaraq, CRISPR əsaslı sistemlərin optimallaşdırılmasına ciddi ehtiyac var.
CRISPR-Cas12a və CRISPR-Cas13a aşkarlama tətbiqləri üçün paralel olaraq 24 analiz apara bilən pnevmatik idarə olunan mikro-maye platforması hazırlanmışdır [91].Sistem nuklein turşusunun gücləndirilməsindən yan keçən və femtomolyar DNT və RNT nümunələrini avtomatik aşkarlayan flüoresan aşkarlama cihazı ilə təchiz edilmişdir.Chen və başqaları.[92] mərkəzdənqaçma mikrofluidiklərdə CRISPR-Cas12a sistemi ilə inteqrasiya olunmuş rekombinaz gücləndirilməsi (Şəkil 5a).Bu iş bu iki prosesin inteqrasiyası çətinliyini aradan qaldırır, çünki Cas12a messencer DNT-ni həzm edə və gücləndirmə prosesini maneə törədə bilər.Bundan əlavə, Chen et al.[92] əlavə olaraq bütün prosesi avtomatik tamamlamaq üçün reaksiya reagentlərini mərkəzdənqaçma mikro-maye nəzarətində əvvəlcədən saxladı.Başqa bir işdə Silva et al.[93] SARS-CoV-2-ni aşkar etmək üçün CRISPR/Cas12a gücləndirilməsi və smartfon olmadan diaqnostika metodu işləyib hazırlayıb (Şəkil 5b).Mobil telefona əsaslanan gücləndirmədən azad sistem kimi tanınan bu analiz mikro-maye kanallarında katalaza ilə yaradılan qabarcıq siqnallarının smartfonda vizuallaşdırılmasına əsaslanan CRISPR/Cas-dan asılı fermenti ehtiva edir.Əvvəlcədən gücləndirilmədən 50 nüsxə/µl-dən az nuklein turşusunun həssas aşkarlanması, nümunənin vurulmasından siqnalın oxunmasına qədər bütün proses cəmi 71 dəqiqə çəkir.
CRISPR əsasında nuklein turşusunun aşkarlanması üsulları.CRISPR əsasında inteqrasiya olunmuş molekulyar diaqnostika üçün mərkəzdənqaçma POCT ([92]-dən uyğunlaşdırılmışdır).b SARS-CoV-2-nin smartfon əsasında təhlili üçün CASCADE testinin hazırlanması ([93]-dən uyğunlaşdırılmışdır).RAA rekombinaz gücləndirilməsi, PAM bitişik protospacer motivi, müntəzəm aralıqlarla CRISPR qruplaşdırılmış qısa palindromik təkrarlar, CRISPR/CAS-dan asılı fermentlər ilə cib telefonu gücləndirilməsi olmadan CASCADE sistemi, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid hidroxlorid
Nuklein turşusunun aşkarlanmasında son addım olaraq, siqnalın aşkarlanması birbaşa diaqnostik nəticələri əks etdirir və səmərəli, həssas və dəqiq POCT-nin inkişafında mühüm amildir.Siqnallar flüoresan, elektrokimyəvi, kolorimetrik və maqnit strategiyaları kimi müxtəlif üsullarla oxuna bilər.Bu bölmədə biz hər bir yanaşmanın əsaslandırılmasını təsvir edirik və mikrofluidiklərdə yoluxucu xəstəliklərin molekulyar diaqnostikasını müqayisə edirik.
Floresensiya əsaslı strategiyalar əla həssaslıq, aşağı qiymət, əməliyyat asanlığı və qayğı nöqtəsi təhlili kimi əlamətdar üstünlüklərinə görə yoluxucu xəstəliklərin POCT diaqnostikasında geniş istifadə olunur [94, 95].Bu strategiyalar aşkar edilə bilən siqnal (flüoresans gücləndirmə və ya söndürmə) yaratmaq üçün flüoresan boyalar və nanomateriallar kimi etiketli flüoroforlardan istifadə edir.Bu tapıntı göstərir ki, flüoresan əsaslı strategiyalar birbaşa flüoresan etiketləmə, siqnalın açılması və siqnalın söndürülməsi üzrə flüoresan aşkarlamaya bölünə bilər [96].Birbaşa flüoresan etiket aşkarlanması bir hədəfə seçici olaraq bağlandıqda müəyyən miqdarda flüoresan meydana gətirən xüsusi liqandları etiketləmək üçün xüsusi flüoresan etiketlərdən istifadə edir.Siqnal əsaslı flüoresans aşkarlanması üçün flüoresan siqnalın keyfiyyəti maraqların böyüklüyü ilə müsbət əlaqələndirilir.Flüoresans intensivliyi hədəf olmadıqda əhəmiyyətsizdir və kifayət qədər hədəf olduqda aşkar edilir.Əksinə, "siqnal söndürmə" flüoresansı ilə aşkar edilən flüoresansiyanın intensivliyi hədəfin miqdarı ilə tərs mütənasibdir, əvvəlcə maksimum dəyərə çatır və hədəf böyüdükcə tədricən azalır.Məsələn, CRISPR-Cas13a hədəfdən asılı trans parçalanma mexanizmindən istifadə edərək, Tian et al.[97] birbaşa tərs transkripsiyadan yan keçən RNT-ləri aşkar etmək üçün yeni bir tanınma strategiyası hazırladı (Şəkil 6a).Tamamlayıcı hədəf RNT-lərə bağlandıqdan sonra CRISPR-Cas13-RNT kompleksi aktivləşdirilə bilər, qeyri-spesifik reportyor RNT-lər tərəfindən transkollateral parçalanmaya səbəb olur.Flüoresan etiketli müxbir [fluorofor (F)] söndürücü (Q) tərəfindən bütöv şəkildə söndürülür və aktivləşdirilmiş kompleks tərəfindən parçalandıqda flüoresanlaşır.
Elektrokimyəvi aşkarlamanın üstünlüyü yüksək aşkarlama sürəti, asan istehsal, aşağı qiymət, asan daşınması və avtomatik idarəetmədir.POCT tətbiqləri üçün güclü analitik metoddur.Qrafen sahə effektli tranzistorlar əsasında Gao et al.[98] aşkarlama həddi 2 pg/mL olan Borrelia burgdorferi bakteriyasından Lyme xəstəliyi antigenlərinin multipleks aşkarlanması üçün nanobiosensor hazırlayıb (Şəkil 6b).
Kolorimetrik analizlər daşına bilmə, aşağı qiymət, asan hazırlanma və vizual oxunma üstünlüklərindən faydalanaraq POCT tətbiqlərində istifadə edilmişdir.Kolorimetrik aşkarlama peroksidaza və ya peroksidaza bənzər nanomaterialların oksidləşməsindən, nanomaterialların aqreqasiyasından və hədəf nuklein turşularının olması haqqında məlumatı görünən rəng dəyişikliklərinə çevirmək üçün göstərici boyaların əlavə edilməsindən istifadə edə bilər [99, 100, 101].Qeyd etmək lazımdır ki, qızıl nanohissəciklər kolorimetrik strategiyaların işlənib hazırlanmasında geniş istifadə olunur və onların sürətli və əhəmiyyətli rəng dəyişiklikləri törətmək qabiliyyətinə görə yoluxucu xəstəliklərin in situ diaqnostikası üçün POCT kolorimetrik platformalarının hazırlanmasına maraq artır [102].İnteqrasiya edilmiş mərkəzdənqaçma mikrofluidik cihaz [103] ilə çirklənmiş süd nümunələrində qida ilə yoluxan patogenlər 10 bakteriya hüceyrəsi səviyyəsində avtomatik aşkarlana bilər və nəticələr 65 dəqiqə ərzində vizual olaraq oxuna bilər (Şəkil 6c).
Maqnit zondlama üsulları maqnit materiallarından istifadə edərək analitləri dəqiq aşkarlaya bilir və son onilliklərdə POCT tətbiqlərinə böyük maraq var.Maqnit zondlama üsulları bahalı optik komponentlərdən daha çox aşağı qiymətli maqnit materialları kimi bəzi unikal üstünlüklərə malikdir.Bununla belə, maqnit sahəsinin istifadəsi aşkarlama effektivliyini artırır və nümunənin hazırlanması müddətini azaldır [104].Bundan əlavə, maqnit zondlamanın nəticələri bioloji nümunələrin əhəmiyyətsiz maqnit fon siqnalına görə yüksək spesifiklik, həssaslıq və yüksək siqnal-küy nisbəti nümayiş etdirir [105].Sharma və başqaları.maqnit tunel qovşağına əsaslanan biosensoru portativ mikroçip platformasına inteqrasiya etdi.[106] patogenlərin multipleks aşkarlanması üçün (Şəkil 6d).Biosensorlar patogenlərdən təcrid olunmuş subnanomolyar nuklein turşularını həssas şəkildə aşkarlayır.
Tipik siqnal aşkarlama üsulu.Cas13a-nın hiperlokallaşdırılmış aşkarlanması konsepsiyası ([97]-dən uyğunlaşdırılmışdır).b Lyme GroES scFv ilə birlikdə qrafen nanobiosensor FET ([98]-dən uyğunlaşdırılmışdır).c Mərkəzdənqaçma mikrofluidik çipdə qida mənşəli patogenlərin multipleks aşkarlanması üçün kolorimetrik göstəricilər: hədəf patogenləri olan №1 və №3 nümunələr və hədəf patogenləri olmayan №2, №4 və 5 nömrəli nümunələr ([103]-dən uyğunlaşdırılmışdır) .d Platforma, quraşdırılmış bloklayıcı gücləndirici, idarəetmə bloku və siqnalın yaradılması/alınması üçün enerji təchizatı daxil olmaqla maqnit tunel qovşağına əsaslanan biosensor ([106]-dan uyğunlaşdırılmışdır).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetil metakrilat
Yuxarıdakı aşkarlama üsullarının əla xüsusiyyətlərinə baxmayaraq, onların hələ də mənfi cəhətləri var.Bu üsullar müqayisə edilir (cədvəl 1), o cümlədən təfərrüatlı bəzi tətbiqlər (müsbət və mənfi cəhətləri).
Mikrofluidikanın, mikroelektromexaniki sistemlərin, nanotexnologiyanın və materialşünaslığın inkişafı ilə yoluxucu xəstəliklərin aşkarlanması üçün mikrofluidik çiplərin istifadəsi daim inkişaf edir [55,96,107,108].Miniatür avadanlıq və mayelərin dəqiq manipulyasiyası diaqnostik dəqiqliyə və qənaətcilliyə kömək edir.Buna görə də, gələcək inkişaf üçün çipləri optimallaşdırmaq və təkmilləşdirmək üçün səylər göstərildi, nəticədə müxtəlif struktur və funksiyalara malik müxtəlif mikrofluidik çiplər əldə edildi.Burada bir neçə ümumi mikrofluidik platforma növlərini qısaca təqdim edirik və onların xüsusiyyətlərini (müsbət və mənfi cəhətləri) müqayisə edirik.Bundan əlavə, aşağıda sadalanan nümunələrin əksəriyyəti ilk növbədə SARS-CoV-2 ilə mübarizəyə yönəlmişdir.
LOCC-lər ən çox yayılmış miniatürləşdirilmiş mürəkkəb analitik sistemlərdir və onların əməliyyatları nümunənin vurulması və hazırlanması, axına nəzarət və mayenin aşkarlanmasından yüksək dərəcədə miniatürləşdirilmiş, inteqrasiya edilmiş, avtomatlaşdırılmış və paralelləşdirilmişdir [109, 110].Mayelər diqqətlə hazırlanmış həndəsə və təzyiq gradientləri, kapilyar hərəkətlər, elektrodinamika, maqnit sahələri və akustik dalğalar kimi bir çox fiziki təsirlərin qarşılıqlı təsiri ilə idarə olunur [111].LOCC sürətli analiz sürəti, kiçik nümunə ölçüsü, aşağı enerji istehlakı və yüksək idarəetmə və əməliyyat səmərəliliyi ilə yüksək məhsuldarlıqlı skrininq və çoxsaylı aşkarlamada əla üstünlüklər göstərir;lakin, LOCC cihazları çox incədir və istehsal, qablaşdırma və interfeysdir.Bununla belə, multipleksləşdirmə və təkrar istifadə böyük çətinliklərlə üzləşir [96].Digər platformalarla müqayisədə, LOCC maksimum tətbiq müxtəlifliyi və ən yaxşı texnologiya uyğunluğu baxımından unikal üstünlüklərə malikdir, lakin onun çatışmazlıqları da göz qabağındadır, yəni yüksək mürəkkəblik və zəif təkrarlanabilirlik.Çox vaxt həcmli və bahalı olan xarici nasoslardan asılılıq onların POCT-də istifadəsini daha da məhdudlaşdırır.
COVID-19 epidemiyası zamanı LOCC çox diqqət çəkdi.Eyni zamanda, bir neçə texnologiyanı birləşdirən bir neçə yeni çip var.Məsələn, smartfonlar hazırda portativ analitik cihazlar kimi geniş istifadə olunur və LOCC inteqrasiyası üçün böyük potensiala malikdir.Sun və başqaları.[21] LAMP istifadə edərək SARS-CoV-2 də daxil olmaqla beş patogenin spesifik nuklein turşusu ardıcıllığını multipleksləşdirməyə imkan verən mikrofluidik çip hazırladı və reaksiya bitdikdən sonra 1 saat ərzində smartfon vasitəsilə təhlil etdi.Başqa bir misal olaraq Sundah et al.[112] smartfonlardan istifadə edərək SARS-CoV-2 RNT hədəflərinin birbaşa və həssas aşkarlanması üçün molekulyar keçid [molekulyar keçid vəziyyəti açarı (CATCH) ilə katalitik gücləndirmə] yaratdı. CATCH portativ LOCC ilə uyğun gəlir və üstün performansa nail olur (təxminən 8 RNT nüsxəsi/μl; otaq temperaturunda < 1 saat) [112]. CATCH portativ LOCC ilə uyğun gəlir və üstün performansa nail olur (təxminən 8 RNT nüsxəsi/μl; otaq temperaturunda < 1 saat) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC və обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температурае) [112]. CATCH portativ LOCC ilə uyğun gəlir və əla ötürmə qabiliyyətini təmin edir (təxminən 8 RNT nüsxəsi/µl; otaq temperaturunda < 1 saat) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNT 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[1]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNT 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[1]。 CATCH совместим с портативными LOCC və обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной temperature) [112]. CATCH portativ LOCC-lərlə uyğun gəlir və əla performansa malikdir (təxminən 8 RNT nüsxəsi/µl; otaq temperaturunda < 1 saat) [112].Bundan əlavə, molekulyar diaqnostika üçün LOCC cihazları vakuum, uzanma və elektrik sahələri kimi bəzi hərəkətverici qüvvələrdən də istifadə edir.Kang və başqaları.[113] vakuum plazmonik maye PCR çipindən istifadə edərək sahədə COVID-19-un sürətli və kəmiyyət diaqnostikası üçün real vaxt rejimində, ultra sürətli nanoplazma-on-a-chip PCR nümayiş etdirdi.Li və başqaları.[114] daha sonra COVID-19 diaqnozuna imkan verən uzanan idarə olunan mikrofluidik çip hazırladı.Platforma nümunənin keyfiyyətcə müsbət və ya mənfi olduğunu müəyyən etmək üçün RT-LAMP gücləndirmə sistemindən istifadə edir.Sonradan, Ramachandran et al.[115] mikrofluidikada tətbiq olunan seçici ion fokuslama texnikası olan izotakoforezdən (ITP) istifadə edərək müvafiq elektrik sahəsinin qradiyenti əldə etmişdir.ITP ilə xam nazofarengeal tampon nümunələrindən hədəf RNT avtomatik olaraq təmizlənə bilər.Sonra Ramachandran et al.[115] Bu ITP təmizlənməsini ITP ilə gücləndirilmiş LAMP və CRISPR analizləri ilə birləşdirərək, təxminən 35 dəqiqə ərzində insan nazofarengeal tamponda və klinik nümunələrdə SARS-CoV-2 aşkar etdi.Bundan əlavə, daim yeni ideyalar ortaya çıxır.Jadhav və başqaları.[116] şaquli yönümlü qızıl/gümüşlə örtülmüş karbon nanoborucuqları və ya birdəfəlik elektrospun mikro/nanoboruları ehtiva edən mikrofluidik cihazla birlikdə səthi gücləndirilmiş Raman spektroskopiyasına əsaslanan diaqnostik sxem təklif etmişdir.Membran funksiyalı daxili filtr mikrokanalları birdəfəlik istifadə olunur.Cihaz tüpürcək, nazofarenks və göz yaşları kimi müxtəlif bədən mayeləri/eksudasiyalarından virusları adsorbsiya edir.Beləliklə, virus titri boldur və virus Raman imzası ilə dəqiq müəyyən edilə bilər.
LOAD, bütün proseslərin mikrostrukturlu substratı fırlanan tezlik protokolu ilə idarə olunduğu mərkəzdənqaçma mikro-maye platformasıdır [110].LOAD cihazı mərkəzdənqaçma qüvvəsindən mühüm hərəkətverici qüvvə kimi istifadə edilməsi ilə xarakterizə olunur.Mayelər də kapilyar, Eyler və Koriolis qüvvələrinə məruz qalırlar.Bir sentrifuqa cihazından istifadə edərək, əlavə xarici borulara, nasoslara, aktuatorlara və aktiv klapanlara ehtiyacı aradan qaldıraraq, radial içəridən xaricə doğru davamlı maye əməliyyatında təhlillər aparılır.Bir sözlə, tək nəzarət üsulu əməliyyatı asanlaşdırır.Yük mərkəzindən eyni məsafədə eyni mikrofluidik kanalda mayeyə təsir edən qüvvələr bərabərdir, bu da kanal quruluşunu təkrarlamağa imkan verir.Beləliklə, LOAD avadanlığının dizaynı və istehsalı adi LOCC avadanlığına nisbətən daha sadə və qənaətcildir, eyni zamanda reaksiyalar əsasən müstəqil və paraleldir;lakin, mərkəzdənqaçma avadanlığının yüksək mexaniki gücünə görə mövcud çip materialı məhduddur və kiçik həcmlər çətindir.maşına.Eyni zamanda, LOAD cihazlarının əksəriyyəti yalnız birdəfəlik istifadə üçün nəzərdə tutulmuşdur ki, bu da geniş miqyaslı aşkarlama üçün baha başa gəlir [96, 117, 118, 119].
Son onilliklərdə ən perspektivli mikrofluidik cihazlardan biri hesab edilən LOAD tədqiqatçılar və istehsalçıların böyük diqqətini çəkmişdir.Beləliklə, LOAD geniş qəbul qazandı və xüsusilə COVID-19 epidemiyası zamanı yoluxucu patogenlərin [120, 121, 122, 123, 124] molekulyar diaqnostikası üçün istifadə edildi.Məsələn, 2020-ci ilin sonunda Ji et al.[60] boğaz tampon nümunələrində SARS-CoV-2 və qrip A və B infeksiyalarının sürətli və avtomatlaşdırılmış paralel aşkarlanması üçün birbaşa RT-qPCR analizini nümayiş etdirdi.Sonra Xiong et al.[74] 40 dəqiqə ərzində SARS-CoV-2 də daxil olmaqla yeddi insan tənəffüs koronavirusunun sürətli, dəqiq və eyni vaxtda aşkarlanması üçün LAMP ilə inteqrasiya olunmuş diskoid mikrofluidik platforma təqdim etdi.2021-ci ilin əvvəlində de Oliveira et al.[73] COVID-19-un RT-LAMP molekulyar diaqnostikası üçün barmaq ucu rotatoru ilə əl ilə idarə olunan polistirol toner mərkəzdənqaçma mikrofluidik çipi nümayiş etdirdi.Sonradan, Dignan et al.[39] SARS-CoV-2 RNT-nin birbaşa bukkal tampon bölmələrindən təmizlənməsi üçün avtomatlaşdırılmış portativ sentrifuqa mikrocihazını təqdim etdi.Medved və b.[53] 10 nüsxə/μL aşkarlama həddi və minimum dövr həddi 15 dəqiqə olan kiçik həcmli fırlanan mikrofluidik flüoresan çipi olan daxili SARS-CoV-2 aerozol nümunəsi sistemini təklif etdi.Suarez və başqaları.[75] bu yaxınlarda LAMP istifadə edərək istiliklə təsirsizləşdirilmiş nazofarengeal tampon nümunələrində SARS-CoV-2 RNT-nin birbaşa aşkarlanması üçün inteqrasiya olunmuş modul mərkəzdənqaçma mikro-maye platformasının işlənib hazırlanması haqqında məlumat verdi.Bu nümunələr COVID-19-un molekulyar diaqnostikasında YÜKLƏNİN böyük faydalarını və vədlərini nümayiş etdirir.
1945-ci ildə Muller və Clegg [125] ilk dəfə filtr kağızı və parafin istifadə edərək kağız üzərində mikrofluid kanallarını təqdim etdilər.2007-ci ildə Whitesides qrupu [126] zülal və qlükoza testi üçün ilk funksional kağız platformasını yaratdı.Kağız mikrofluidiklər üçün ideal substrata çevrilmişdir.Kağız hidrofiliklik və məsaməli struktur, əla biouyğunluq, yüngül çəki, elastiklik, qatlanabilmə, aşağı qiymət, istifadə asanlığı və rahatlıq kimi xas xüsusiyyətlərə malikdir.Klassik µPAD-lər kağız substratlar üzərində qurulmuş hidrofilik/hidrofobik strukturlardan ibarətdir.Üçölçülü strukturdan asılı olaraq μPAD-ləri ikiölçülü (2D) və üçölçülü (3D) μPAD-lərə bölmək olar.2D µPAD-lər mikrofluidik kanallar yaratmaq üçün hidrofobik sərhədlər yaratmaqla istehsal olunur, 3D µPAD-lər isə adətən 2D mikrofluidik kağız təbəqələrinin yığınlarından, bəzən kağız qatlama, sürüşmə üsulları, açıq kanallar və 3D çap yolu ilə hazırlanır [96].μPAD üzərindəki sulu və ya bioloji mayelər ilk növbədə xarici enerji mənbəyi olmadan kapilyar qüvvə ilə idarə olunur, reagentlərin əvvəlcədən saxlanmasını, nümunələrin işlənməsini və multipleks aşkarlanmasını asanlaşdırır.Bununla belə, dəqiq axın nəzarəti və multipleks aşkarlanması qeyri-kafi aşkarlama sürəti, həssaslıq və təkrar istifadə imkanları ilə maneə törədir [96, 127, 128, 129, 130].
Qeyri-adi mikrofluidik platforma kimi μPAD HCV, HİV və SARS-CoV-2 [131, 132] kimi yoluxucu xəstəliklərin molekulyar diaqnostikası üçün geniş şəkildə təbliğ edilmiş və inkişaf etdirilmişdir.HCV-nin seçici və həssas aşkarlanması üçün Tengam et al.[133] pirolidinil peptid əsasında yüksək spesifik nuklein turşusu zondundan istifadə edərək flüoresan kağıza əsaslanan yeni biosensor hazırladı.Nuklein turşuları amin qrupları və aldehid qrupları arasında reduktiv alkilləşmə yolu ilə qismən oksidləşmiş selüloz kağızı üzərində kovalent şəkildə immobilizasiya edilir və aşkarlama flüoresansla aparılır.Bu siqnalları mobil telefon kamerası ilə birlikdə portativ flüoresan kamera ilə xüsusi hazırlanmış qadcet oxuya bilər.Sonradan, Lu et al.[134] DNT redoks göstəricisi kimi metilen mavisindən istifadə edərək DNT hibridləşməsi ilə HİV hədəfinin aşkarlanması üçün nikel/qızıl nanohissəcikləri/karbon nanoborucuqları/polivinil spirti orqanometalik çərçivə kompozitlərinə əsaslanan kağız əsaslı çevik elektrod hazırlamışdır.Bu yaxınlarda Chowdury et al.[135] COVID-19 analitinin aşkarlanması üçün LAMP və portativ görüntüləmə texnologiyası ilə birlikdə xam xəstə tüpürcəkindən istifadə edərək qayğı nöqtəsi µPAD testi üçün hipotetik platforma dizaynını təqdim etdi.
Yanal axın testləri mayeləri kapilyar qüvvələrlə istiqamətləndirir və məsaməli və ya mikrostrukturlu substratların nəmlənmə qabiliyyətinə və xüsusiyyətlərinə görə mayenin hərəkətinə nəzarət edir.Yanal axın cihazları nümunə, konjugat, inkubator və aşkarlayıcı və uducu yastıqlardan ibarətdir.LFA-dakı nuklein turşusu molekulları bağlama yerində əvvəlcədən saxlanılan və komplekslər kimi bağlanan xüsusi bağlayıcıları tanıyır.Maye inkubasiya və aşkarlama lövhələrindən keçərkən, komplekslər test və nəzarət xətlərində yerləşən tutma molekulları tərəfindən tutulur və birbaşa gözlə oxuna bilən nəticələr göstərir.Tipik olaraq, LFA 2-15 dəqiqə ərzində tamamlana bilər ki, bu da ənənəvi kəşfdən daha sürətlidir.Xüsusi mexanizm sayəsində LFA bir neçə əməliyyat tələb edir və əlavə avadanlıq tələb etmir, bu da onu çox istifadəçi dostu edir.İstehsal etmək və miniatürləşdirmək asandır və kağız əsaslı substratların dəyəri daha aşağıdır.Bununla belə, o, yalnız keyfiyyət analizi üçün istifadə olunur və kəmiyyət aşkarlanması çox çətindir, çoxalma qabiliyyəti və ötürmə qabiliyyəti çox məhduddur və bir anda yalnız bir kifayət qədər nuklein turşusu aşkar edilə bilər [96,110,127].
LFA-nın əksər tətbiqləri immunoanalizlərə yönəldilsə də, mikrofluidik çiplərdə molekulyar diaqnostika üçün LFA-nın istifadəsi də effektiv və populyardır [136].Hepatit B virusu, HİV və SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] yuxarıya çevrilən nanohissəcik LFA platformasını təklif etdi və HBV nuklein turşusu kimi çoxsaylı hədəflərin həssas və kəmiyyətcə aşkarlanması vasitəsilə bu miniatürləşdirilmiş və daşınan platformanın çox yönlülüyünü nümayiş etdirdi.Bundan əlavə, Fu et al.[138] aşağı konsentrasiyalarda HİV-1 DNT-nin kəmiyyət analizi üçün səthi gücləndirilmiş Raman spektroskopiyasına əsaslanan yeni LFA nümayiş etdirdi.SARS-CoV-2-nin sürətli və həssas aşkarlanması üçün Liu et al.[85] RT-RPA və universal yanal axın aşkarlama sistemini vahid mikrofluidik sistemdə birləşdirərək mikrofluidik-inteqrasiya edilmiş RPA yanal axın təhlili hazırlamışdır.
Müxtəlif mikrofluidik platformaların tətbiqi platformaların imkanlarından və üstünlüklərindən tam istifadə etməklə konkret tədqiqatlardan asılı olaraq dəyişir.Əlverişli qiymətli klapanlar, nasoslar və kanallar ilə LOCC proqram müxtəlifliyi və inkişaf üçün ən geniş otaq ilə qarşılıqlı fəaliyyət üçün ən əhatəli platformadır.Buna görə də ümid edirik və tövsiyə edirik ki, ilk cəhd olaraq LOCC-də ən yeni tədqiqatlar aparılsın və şərtlər optimallaşdırılsın.Bundan əlavə, sistemdə daha səmərəli və dəqiq üsulların aşkar edilərək tətbiqi gözlənilir.LOAD mövcud LOCC cihazlarından mayelərin dəqiq idarə edilməsində üstündür və xarici sürücülərə ehtiyac olmadan mərkəzdənqaçma qüvvəsi ilə tək sürücülərdə unikal üstünlüklər nümayiş etdirir, paralel cavablar isə ayrıca və sinxronlaşdırıla bilər.Beləliklə, gələcəkdə LOAD daha az əl əməliyyatları və daha yetkin və avtomatlaşdırılmış texnologiyaları olan əsas mikrofluid platformasına çevriləcəkdir.µPAD platforması aşağı qiymətli, birdəfəlik diaqnostika üçün LOCC və kağız əsaslı materialların üstünlüklərini birləşdirir.Buna görə gələcək inkişaf rahat və yaxşı qurulmuş texnologiyalara yönəldilməlidir.Bundan əlavə, LFA çılpaq gözlə aşkarlanması üçün çox uyğundur, nümunə istehlakını azaltmaq və aşkarlanmanı sürətləndirmək vəd edir.Ətraflı platforma müqayisəsi Cədvəl 2-də göstərilmişdir.
Rəqəmsal analizlər nümunəni çoxlu mikroreaktorlara bölür, onların hər birində ayrı-ayrı hədəf molekulları var [139, 140].Rəqəmsal analizlər davamlı fazada deyil, mikron miqyaslı bölmələrdə eyni vaxtda və fərdi olaraq minlərlə paralel biokimyəvi təcrübələr həyata keçirməklə mütləq kəmiyyətin təyin edilməsi üçün əhəmiyyətli üstünlüklər təklif edir.Ənənəvi mikrofluidiklərlə müqayisədə bölmə reaksiyaları nümunənin həcmini azalda, reaksiyanın səmərəliliyini artıra və kanallara, nasoslara, klapanlara və kompakt dizaynlara ehtiyac olmadan asanlıqla digər analitik üsullarla birləşdirilə bilər [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Reagentlər və hüceyrələr, nuklein turşuları və digər hissəciklər və ya molekullar kimi nümunələr də daxil olmaqla məhlulların vahid və dəqiq ayrılmasına nail olmaq üçün rəqəmsal analizlərdə aşağıdakı iki üsuldan istifadə olunur: (1) maye interfeysinin qeyri-sabitliyindən istifadə edən damcı emulsiyaları;(2) massivlərin bölünməsi cihazın həndəsi məhdudiyyətləri ilə həyata keçirilir.Birinci üsulda mikrokanallarda reagentlər və nümunələr olan damlacıqlar co-cərəyan, çarpaz axın, axın fokuslanması, mərhələli emulsifikasiya, mikrokanal emulsifikasiyası və membranların viskoz kəsmə qüvvələri və kanal dəyişikliyi ilə emulsifikasiya kimi passiv üsullarla yaradıla bilər.lokalizasiya [143, 145, 146, 148, 149] və ya elektrik, maqnit, istilik və mexaniki nəzarət vasitəsilə əlavə enerji təqdim edən aktiv üsullardan [150, 151] istifadə etməklə.Sonuncu yanaşmada, mikrofluidik kameralarda ən yaxşı maye həcminin vahidliyi mikropits və səth massivləri kimi eyni ölçülü məkan strukturlarını saxlamaqla paylaşılır [152,153,154].Qeyd edək ki, damcılar rəqəmsal mikrofluidiklərə (DMF) əsaslanan elektrod massivlərində də yaradıla və idarə oluna bilən əsas axın hissələridir.Dielektriklərin elektrowetləşdirilməsi ən yaxşı öyrənilmiş DMF nəzəriyyələrindən biridir, çünki dielektriklərin elektronəmləndirilməsi ayrı-ayrı damcıların dəqiq manipulyasiyasına, mayenin formasına və müxtəlif tərəflərdən keçən asimmetrik elektrik siqnallarına nəzarət etməyə imkan verir [141, 144].DMF-də damcılarla əsas əməliyyatlara çeşidləmə, parçalama və birləşmə daxildir [151, 155, 156] ki, bu da analizin müxtəlif sahələrində, xüsusən də molekulyar aşkarlamada tətbiq oluna bilər [157, 158, 159].
Rəqəmsal nuklein turşusunun aşkarlanması yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı və maye biopsiyası ilə paralel olaraq adi PCR və kəmiyyət real zamanlı PCR (qPCR) sonrasında üçüncü nəsil molekulyar diaqnostika texnologiyasıdır.Son iki onillikdə rəqəmsal nuklein turşuları yoluxucu patogenlərin molekulyar diaqnostikası sahəsində sürətlə inkişaf etmişdir [160, 161, 162].Rəqəmsal nuklein turşusunun aşkarlanmasının mütləq kəmiyyəti nümunələrin və reagentlərin ayrı-ayrı bölmələrə qablaşdırılması ilə başlayır ki, hər bir hədəf ardıcıllığının hər bir fərdi bölməyə daxil olma ehtimalı eyni olsun.Teorik olaraq, hər bir bölməyə bir neçə hədəf ardıcıllığı təyin edilə bilər və ya müstəqil mikroreaksiya sistemi olmaya bilər.Yuxarıda təsvir edilən müxtəlif algılama mexanizmləri vasitəsilə müəyyən hədddən yuxarı siqnallar yaradan mikrob hədəf ardıcıllığı olan bölmələr çılpaq gözlə və ya maşın vasitəsilə görüntülənə bilər və pozitiv kimi etiketlənir, eşikdən aşağı siqnallar yaradan digər bölmələr isə müsbət kimi etiketlənir. .mənfi olanlar, hər bölmə üçün siqnalı boolean edir.Beləliklə, yaradılan bölmələrin sayını və reaksiyadan sonra müsbət nəticələrin dərəcəsini hesablamaqla, test nümunələrinin orijinal nüsxələri standart əyriyə ehtiyac olmadan Poisson paylama düsturundan istifadə etməklə uyğunlaşdırıla bilər, bu kimi müntəzəm kəmiyyət analizləri üçün tələb olunur. qPCR kimi.[163] Ənənəvi molekulyar diaqnostika üsulları ilə müqayisədə rəqəmsal nuklein turşusunun aşkarlanması daha yüksək avtomatlaşdırma dərəcəsinə, daha yüksək analiz sürətinə və həssaslığa, daha az reagentə, daha az çirklənməyə, daha sadə dizayn və istehsala malikdir.Bu səbəblərə görə, SARS-CoV-2-nin kritik epidemiyası zamanı gücləndirmə və siqnal oxuma üsullarını birləşdirən molekulyar diaqnostika üçün rəqəmsal analizlərin, xüsusən də damcı əsaslı metodların istifadəsi yaxşı öyrənilmişdir.Məsələn, Yin et al.[164] mikrofluidik çipdə SARS-CoV-2-də ORF1ab, N və RNase P genlərini aşkar etmək üçün damcı rəqəmsal və sürətli PCR üsullarını birləşdirdi.Qeyd etmək lazımdır ki, sistem 115 saniyə ərzində müsbət siqnalı müəyyən edə bilmişdir ki, bu da adi PCR-dən daha sürətlidir ki, bu da onun qayğı nöqtəsinin aşkarlanmasında effektivliyini göstərir (Şəkil 7a).Dong və başqaları.[165], Sow və başqaları.[157], Chen et al.[166] və Alteri et al.[167] həmçinin təsir edici nəticələrlə mikrofluidik sistemdə SARS-CoV-2-ni aşkar etmək üçün damcı rəqəmsal PCR (ddPCR) tətbiq etdi.Aşkarlama dərəcəsini daha da yaxşılaşdırmaq üçün Shen et al.[168] ddPCR-əsaslı çip təsvirini 15 saniyəyə qədər qısa bir müddətdə təsvir tikmə üsullarından istifadə etmədən əldə etdi, ddPCR texnologiyası prosesini laboratoriyadan tətbiqə qədər sürətləndirdi.Yalnız PCR kimi termal gücləndirmə üsulları tətbiq edilmir, həm də reaksiya şərtlərini və sürətli cavabı sadələşdirmək üçün izotermik gücləndirmə üsullarından da istifadə olunur.Lu və başqaları.[71] damcı analizi üçün bir addımda yüksək sıxlıqda müxtəlif ölçülü damlacıqlar yarada və rəqəmsal LAMP istifadə edərək SARS-CoV-2 nuklein turşularının miqdarını təyin edə bilən SlipChip işləyib hazırladı (Şəkil 7b).Sürətlə inkişaf edən texnologiya olaraq, CRISPR əlavə nuklein turşusu ləkələrinə ehtiyac olmadan rahat kolorimetrik görüntüləmə vasitəsilə rəqəmsal nuklein turşusunun aşkarlanmasında da mühüm rol oynaya bilər.Ackerman və başqaları.nuklein turşularının multipleks qiymətləndirilməsi üçün kombinator matris reaksiyasını işləyib hazırlamışdır.[158] mikro quyu analizində CRISPR-Cas13 əsaslı nuklein turşusu aşkarlama reagentləri olan damcılarda SARS-CoV-2 daxil olmaqla 169 insanla əlaqəli virus aşkar etdi (Şəkil 7c).Bundan əlavə, izotermik gücləndirmə və CRISPR texnologiyası hər ikisinin üstünlüklərini birləşdirmək üçün eyni sistemdə istifadə edilə bilər.Park et al.[169] CRISPR/Cas12a rəqəmsal analizi, daha qısa və daha yüksək siqnal-fon aşkarlanması ilə bir mərhələli RT-RPA əsasında çıxarılan və istiliklə öldürülmüş SARS-CoV-2-nin aşkarlanması üçün kommersiya mikroflüid çipində işlənib hazırlanmışdır. vaxt nisbəti., daha geniş dinamik diapazon və daha yaxşı həssaslıq (Şəkil 7d).Bu nümunələrin bəzi təsvirləri Cədvəl 3-də verilmişdir.
Nuklein turşusunun aşkarlanması üçün tipik rəqəmsal platforma.a Sürətli rəqəmsal PCR iş axını dörd əsas addımdan ibarətdir: nümunənin hazırlanması, reaksiya qarışığının paylanması, gücləndirmə prosesi və hədəfin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi ([164]-dən uyğunlaşdırılmışdır).b Yüksək sıxlıqda damcı əmələ gəlməsi üçün SlipChip damcılarının sxematik təhlili ([71]-dən uyğunlaşdırılmışdır).c CARMEN-Cas iş axını diaqramı13 ([158]-dən uyğunlaşdırılmışdır).d Bir qazanda CRISPR/Cas ilə qabaqcıl rəqəmsal virus aşkarlanmasının icmalı ([169]-dan uyğunlaşdırılmışdır).Yağda su, polidimetilsiloksan PDMS, PCR polimeraza zəncirvari reaksiya, DAQ məlumatlarının toplanması, PID mütənasib inteqral törəməsi, multipleks nuklein turşusunun qiymətləndirilməsi üçün CARMEN kombinatorial matriks reaksiyası, SARS-CoV-2, ağır kəskin respirator sindrom, koronavirus2 RT Əks transkriptaza rekombinaz polimeraza-RPA, arxa fonda S/B siqnalının gücləndirilməsi